酵母表面展示EtMic1蛋白不同結(jié)構(gòu)域及其作為抗球蟲活載體疫苗的研究.pdf

1、雞球蟲病是由一種或多種艾美耳科、艾美耳屬的球蟲寄生于雞的腸上皮細胞內(nèi)所引起的寄生原蟲病，是對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失的疾病之一。目前，球蟲病在養(yǎng)禽業(yè)的控制策略主要是采用抗球蟲藥、強毒活疫苗、減毒活疫苗。但他們自身存在的一些缺點使得雞球蟲病的預防未能達到理想的效果，因而研發(fā)廉價高效的新型疫苗已成為緩解養(yǎng)禽業(yè)虧損的當務(wù)之急，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷提高，雞球蟲基因/DNA疫苗，及亞單位疫苗的研究越來越引起人們的重視，此類疫苗與活苗相比具有一定的

2、優(yōu)勢，但其仍有很多局限性。而活載體疫苗具有免疫效力高、生產(chǎn)成本低及安全性能好等不可比擬的優(yōu)勢，為新型球蟲疫苗的研發(fā)提供了重要方向。
　　首先篩選鑒定保護性蛋白質(zhì)抗原是研制活載體疫苗的關(guān)鍵，柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白1(EtMic1)可以作為新型疫苗的候選抗原來阻斷子孢子侵入宿主細胞。其次選擇合適的傳遞載體對于研制活載體疫苗也是非常重要的。而在眾多活載體疫苗傳遞系統(tǒng)中，釀酒酵母表面展示系統(tǒng)可作為一個獨特的真核表達系統(tǒng)，適用于表達球蟲抗原

3、。釀酒酵母表面展示系統(tǒng)不僅具有疫苗傳遞的便利性，當接種酵母口服活疫苗時，酵母細胞壁還能增強機體先天性免疫。
　　因此，在本研究中，我們從SD-01株柔嫩艾美耳球蟲的第二代裂殖子總RNA中擴增并克隆了EtMIC1基因，并根據(jù)EtMIC1不同結(jié)構(gòu)域?qū)⑵浞殖?段:EtMIC1-Ⅰ包括Ⅰ-結(jié)構(gòu)域、TSP-1和TSP-2結(jié)構(gòu)域;EtMIC1-Ⅱ包括Ⅰ-結(jié)構(gòu)域和5個TSP結(jié)構(gòu)域;EtMIC1-Ⅲ包含TSP-2、TSP-3和TSP-4結(jié)構(gòu)域。使

4、用EBY100/pCTCON2酵母表面展示系統(tǒng)，構(gòu)建3種包含有EtMic1不同結(jié)構(gòu)域重組質(zhì)粒，制備了口服活疫苗免疫雛雞。實驗動物分為7組，即未免疫未攻蟲組（Ⅰ組）、未免疫攻蟲組（Ⅱ組）、免疫EBY100組(Ⅲ組)、免疫EBY/pCT組（Ⅳ組）、免疫EBY/pCT-EtMic1-Ⅰ組（Ⅴ組）、免疫EBYpCT-EtMic1-Ⅱ組(Ⅵ組)和免疫EBY/pCT-EtMic1-Ⅲ組(Ⅶ組)，連續(xù)免疫28天后攻柔嫩艾美耳球蟲，并通過評價體重增長、

5、相對增重率、盲腸損傷計分、卵囊排出量、卵囊減少率、抗球蟲指數(shù)、血清抗體水平和脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，比較它們對柔嫩艾美耳球蟲感染的免疫保護效率。結(jié)果顯示，與對照組比較，免疫EBY/pCT-EtMic1-Ⅰ、EBY/pCT-EtMic1-Ⅱ和EBY/pCT-EtMic1-Ⅲ的實驗組均顯示出一定的免疫保護力，攻蟲7天后相對增重率分別為83.31％，85.34％和90.82％;卵囊排出減少率分別74.39％、75.74％和79.01％;盲腸病變記

6、分分別為1.74、1.69和1.20; ACI分別為164.91、167.44和177.82。實驗結(jié)果顯示三種含有EtMIC1不同結(jié)構(gòu)域的重組質(zhì)粒的口服活載體疫苗表現(xiàn)出了不同的免疫保護效率，同時在提高特異性抗體應(yīng)答和脾細胞轉(zhuǎn)化能力等方面均表現(xiàn)出顯著的不同。酵母表面展示的EtMic1-Ⅲ與酵母表面展示的EtMic1-Ⅰ和EtMic1-Ⅱ相比提供了更好的免疫保護。由于該系統(tǒng)排除了抗生素抗性基因的污染，釀酒酵母的菌株EBY100可以很好的用作