復(fù)方“克清甲”軟膏劑的研制及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、安全性和藥效學(xué)研究.pdf

1、甲念珠菌病是由念珠菌引起的一類特殊類型甲病，病原菌以白色念珠菌最多見。臨床廣泛采用化學(xué)藥物治療，但其價(jià)格昂貴并存在較嚴(yán)重的毒副作用。前期研究表明，傳統(tǒng)中藥驗(yàn)方中治療甲癬等皮膚病的組方：苦參（Radix Sophorae Flavescentis）、土茯苓（Rhizoma Smilacis Glabrae）和白鮮皮（Cortex Dictamni）均對(duì)白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制作用。咪唑類抗真菌藥硝酸咪康唑?qū)Π咨钪榫鸵恍┍砥ふ婢辛己每?/p>

2、菌作用。為開發(fā)新型抗真菌劑，本研究探討了配方中藥有效成分的最佳提取工藝，考察了配方中藥提取物與硝酸咪康唑的體外聯(lián)合抑菌活性，并將二者組成復(fù)方制成軟膏劑，在此基礎(chǔ)上對(duì)軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、體外安全性和體外藥效學(xué)進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.配方中藥的提取工藝研究：通過正交試驗(yàn)考察A(乙醇濃度)、B（提取時(shí)間/次）、C（苦參：土茯苓：白鮮皮）、D（固液比）四個(gè)因素對(duì)配方中藥乙醇回流提取工藝的影響，并以提取物對(duì)白色念珠菌的最低抑菌

3、濃度(minimal inhibitoryconcentration，MIC)為衡量指標(biāo)，篩選最佳提取工藝：并用化學(xué)方法對(duì)配方中藥提取物進(jìn)行了成分預(yù)試。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，配方中藥提取物的最佳提取工藝為：A3B2C3D1，即70％乙醇，苦參：土茯苓：白鮮皮比例為2:2:1，固液比為1:10，每次提取2h;提取物得率為23％，對(duì)白色念珠菌的MIC值為0.195mg·mL-1。成分預(yù)試結(jié)果表明，配方中藥提取物中主要含有多糖、黃酮和生物堿三大類

4、物質(zhì)。
　　 2.中西藥聯(lián)合效應(yīng)研究：采用棋盤微量稀釋法，考察了配方中藥提取物和硝酸咪康唑聯(lián)合用藥對(duì)白色念珠菌的抑菌活性；通過對(duì)不同比例的配方中藥提取物與2％硝酸咪康唑溶液的抑菌活性研究，篩選最佳配伍比例。結(jié)果表明：聯(lián)合用藥時(shí)，配方中藥提取物的MIC從單用藥時(shí)的0.195mg·mL-1降至0.049mg·mL-1：硝酸咪康唑的MIC由單用藥時(shí)的7.8μg·mL-1降至3.9μg·mL-1；聯(lián)合抑菌指數(shù)為0.751，說明二者聯(lián)合應(yīng)

5、用對(duì)白色念珠菌表現(xiàn)為相加作用；當(dāng)二者比例為3：1和4:1時(shí)，抑菌效果最好，復(fù)方藥液MIC均為0.097mg·mL-1，因此選用3:1進(jìn)行配伍即可。
　　 3.復(fù)方“克清甲”軟膏處方篩選：以配方中藥提取物、硝酸咪康唑、尿素、白凡士林、十八醇、吐溫80、單硬脂酸甘油酯等為原料，制備O/W型復(fù)方“克清甲”軟膏。以軟膏外觀性狀、離心試驗(yàn)、耐熱和耐寒試驗(yàn)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，篩選HLB值、乳化劑及油相用量，優(yōu)化軟膏處方。結(jié)果表明：處方最佳HLB值

6、為10.5，混合乳化劑吐溫80和單硬脂酸甘油酯用量分別為6％和4％，油相白凡士林和十八醇用量分別為8％和7％時(shí)，可制得合格的復(fù)方“克清甲”軟膏。
　　 4.4％復(fù)方“克清甲”軟膏質(zhì)量研究：通過性狀評(píng)價(jià)，參照藥典方法鑒別尿素和苦參堿，以及用薄層單波長(zhǎng)掃描法檢測(cè)苦參堿含量，從而對(duì)軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，本品為稠度適宜，潤(rùn)滑，易于涂布和易洗除的淡黃色軟膏；軟膏樣品經(jīng)處理后能使?jié)駶?rùn)的紅色石蕊試紙變藍(lán)，加入硫酸銅試液后溶液變成藍(lán)

7、紫色，加入硝酸后產(chǎn)生白色結(jié)晶性沉淀，供試品色譜中在與苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯同色斑點(diǎn)，表明可成功鑒別軟膏中的尿素和苦參堿；苦參堿薄層掃描波長(zhǎng)為510nm，回歸方程：y=2036.5x+3842.8，R=0.9951，這一試驗(yàn)結(jié)果表明苦參堿在1-9μg之間時(shí)與吸收面積呈良好線性關(guān)系；專屬性試驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照在樣品與苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上沒有橙紅色斑點(diǎn)，表明軟膏中其他成分對(duì)苦參堿的檢測(cè)無干擾。經(jīng)樣品檢測(cè)，4％復(fù)方“克清甲”軟膏

8、中苦參堿平均含量為0.28％。
　　 5.復(fù)方“克清甲”軟膏體外安全性研究：通過動(dòng)物皮膚急性毒性試驗(yàn)、皮膚刺激性試驗(yàn)、眼刺激試驗(yàn)及皮膚主動(dòng)過敏試驗(yàn)，考察復(fù)方“克清甲”軟膏體外用藥的安全性。結(jié)果表明，復(fù)方“克清甲”軟膏外用無急性毒性反應(yīng)。單次和多次給予受試藥物，家兔完整皮膚均未出現(xiàn)紅斑或水腫現(xiàn)象；家兔破損皮膚在單次和多次給藥時(shí)均略見紅斑，但停藥后完全消退。根據(jù)皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，單次和多次給藥試驗(yàn)的刺激指數(shù)均＜0.5，因此復(fù)方“

9、克清甲”軟膏外用對(duì)皮膚無刺激性。皮膚主動(dòng)過敏試驗(yàn)結(jié)果表明，陽性致敏物的致敏率為100％，即有極度致敏性；復(fù)方軟膏組和空白軟膏組在致敏接觸和激發(fā)接觸中均未出現(xiàn)任何紅斑和水腫等皮膚過敏反應(yīng)，即致敏率為0，復(fù)方“克清甲”軟膏外用不產(chǎn)生過敏反應(yīng)。
　　 6.復(fù)方“克清甲”軟膏體外藥效學(xué)研究：將正常甲板分為對(duì)照組和造模組，造模組甲板又分為不給藥組、基質(zhì)組及藥物治療組（藥物治療組設(shè)三個(gè)濃度：2％，4％和8％）。把造模組甲板加入到含白色念珠菌

10、的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，采樣作病理切片并進(jìn)行PAS染色觀察；同時(shí)將軟膏與造模病甲充分接觸后共同培養(yǎng)，考察復(fù)方“克清甲”軟膏的體外藥效。3周后作病理切片及PAS染色觀察。結(jié)果如下：與正常甲板相比較，染菌2周后的甲板質(zhì)地變硬，外觀呈褐色；顯微鏡下，原本致密有序的角蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，病變部位與正常結(jié)構(gòu)呈明顯分界線。體外藥效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未給藥的造模病甲硬角蛋白結(jié)構(gòu)已完全被破壞，出現(xiàn)斷裂和空洞，并可見其間成團(tuán)的真菌；而各濃度藥物治療組的甲切片中仍可見