用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白[畢業(yè)設(shè)計(jì)+開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p>　　用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 生物工程

2、</p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要：：本文利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了含有丙型肝炎病

3、毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的重組桿狀病毒，并獲得HCV結(jié)構(gòu)蛋白在昆蟲細(xì)胞Sf9中的表達(dá)。具體操作步驟如下：用PCR擴(kuò)增HCV結(jié)構(gòu)區(qū)基因，克隆到桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac l中，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座載體pFB1-CEE，轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌落，抽提大分子質(zhì)粒DNA，獲得含HCV結(jié)構(gòu)區(qū)基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bac-CEE，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收集含有重組桿狀病毒顆粒的培養(yǎng)上清，重新感染Sf9

4、細(xì)胞，收集Sf9細(xì)胞，進(jìn)行12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，可見表達(dá)的蛋白條帶。HCV結(jié)構(gòu)蛋白在昆蟲細(xì)胞中的高效表達(dá)將為進(jìn)一步研制適用于人的HCV預(yù)防性疫苗打下工作基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：HCV結(jié)構(gòu)蛋白；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)； </p><p>　　Expression of Hepatitis C Virus Structural Proteins in Insect Ce

5、ll Using the Baculovirus Expression System</p><p>　　Abstract: In this work，a recombinant baculovirus containing Hepatitis C virus (HCV) structural protein coding sequence was constructed by Bac-to-Bac recomb

6、inant baculovirus expression system and it was proved to be able to produce HCV structural proteins directly in insect cells．In this experiment HCV structural gene was amplified by polymerase chain reaction(PCR)，and was

7、inserted into baculovirus expression vector pFastBac1 to construct a recombinant tansposing vector pFB1-CEE.The plasmid pFB1-</p><p>　　Keywords: HCV structural protein; baculovirus expression system</p>

8、;<p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘要……………………………………………………………………………………………………… I</p><p>　　Abstract……………………………………………………………………………………………………II</p><p><b>　　1 緒論1</b&g

9、t;</p><p>　　一 桿狀病毒的分子生物學(xué)特性1</p><p>　　二 桿狀病毒的基因工程原理1</p><p>　　三 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展2</p><p>　　四 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性3</p><p>　　五 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在HCV基因工程疫苗中的應(yīng)用前景3</p>

10、<p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)材料5</b></p><p>　　2.1細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒載體5</p><p>　　2.1.1 Sf9細(xì)胞5</p><p>　　2.1.2 大腸桿菌5</p><p>　　2.1.3 質(zhì)粒5</p><p>　　2.2 主要試劑及配制5&l

11、t;/p><p>　　2.2.1 分子生物學(xué)試劑5</p><p>　　2.2.2 生化試劑5</p><p>　　2.3 培養(yǎng)液及培養(yǎng)基6</p><p>　　2.3.1 LB培養(yǎng)液及LB平板6</p><p>　　2.3.2 Grace，s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液6</p><p>　　2.4

12、堿法提取質(zhì)粒主要試劑6</p><p>　　2.5 SDS--聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑6</p><p>　　2.5.1 30%(W/V)聚丙烯酰胺溶液6</p><p>　　2.5.2聚丙烯酷胺凝膠電泳緩沖溶液7</p><p>　　2.6 其它主要試劑7</p><p>　　2.7 血清標(biāo)本7</p

13、><p>　　2.8 實(shí)驗(yàn)儀器7</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法8</b></p><p>　　3.1 引物合成及HCV結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(C-El-E2)基因片段的擴(kuò)增8</p><p>　　3.1.1 引物設(shè)計(jì)8</p><p>　　3.1.2 HCV結(jié)構(gòu)區(qū)基因的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的純化

14、8</p><p>　　3.2 重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建9</p><p>　　3.2.1 酶切反應(yīng)9</p><p>　　3.2.2. 目的片段(C-El-E2)及轉(zhuǎn)座載體pFastBac1的回收純化9</p><p>　　3.2.3 目的片段與轉(zhuǎn)座載體pFastBac1連接9</p><p>　　3.2.4 制備

15、感受態(tài)大腸桿菌DH5α及DH5α的轉(zhuǎn)化9</p><p>　　3.2.5 重組轉(zhuǎn)座載體pFB1-CEE的酶切鑒定9</p><p>　　3.3 重組桿狀病毒穿梭載體的獲得10</p><p>　　3.3.1 制備三抗平板:10</p><p>　　3.3.2 制備感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac10</p><p&g

16、t;　　3.3.3 重組pFB1-CEE轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac (轉(zhuǎn)座)10</p><p>　　3.3.4 重組桿狀病毒穿梭載體Bac-CEE DNA的提取10</p><p>　　3.4 重組桿狀穿梭載體病毒Bac-CEE的PCR鑒定11</p><p>　　3.4.1 引物:11</p><p>　　3.4.2

17、PCR反應(yīng):11</p><p>　　3.5 重組桿狀病毒穿梭載體Bac-CEE轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞11</p><p>　　3.5.1 轉(zhuǎn)染Sf9單層細(xì)胞11</p><p>　　3.5.2 重組桿狀病毒的收獲與保存11</p><p>　　3.6 感染后Sf9細(xì)胞的收集12</p><p>　　3.7 Sf9細(xì)

18、胞表達(dá)的HCV結(jié)構(gòu)蛋白的特性分析12</p><p>　　3.7.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析12</p><p>　　3.7.2 表達(dá)蛋白的抗原性初步測(cè)定12</p><p><b>　　4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果12</b></p><p>　　4.1 HCV結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(C-El-E2)基因片段的PCR擴(kuò)增12&l

19、t;/p><p>　　4.2 重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建13</p><p>　　4.3 重組轉(zhuǎn)座載體pFB1-CEE的酶切分析14</p><p>　　4.4 重組桿狀病毒的獲取14</p><p>　　4.5 重組桿狀病毒Bac-CEE的鑒定14</p><p>　　4.6 正常Sf9細(xì)胞形態(tài)和Bac-CEE轉(zhuǎn)染后Sf

20、9細(xì)胞的形態(tài)變化15</p><p>　　4.7 重組蛋白的SDS-PAGE分析15</p><p>　　4.8 表達(dá)蛋白的抗原性檢測(cè)16</p><p><b>　　5 結(jié)論16</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)16</b></p><p>　　致

21、謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　多年來，丙型肝炎疫苗一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。然而，丙型肝炎疫苗研究面臨3個(gè)難題：(1)HCV復(fù)制力差，不易傳代培養(yǎng)，免疫原不易大量制備；(2)HCV基因具有高變異性，且HCV編碼的一些蛋白質(zhì)與HCV的致癌性相關(guān)；(3)HCV具有嚴(yán)格的宿主限制性，迄今為止，黑猩猩是已知的除人類

22、外唯一對(duì)HCV易感的物種。而昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能很好的解決這些問題。</p><p>　　一 桿狀病毒的分子生物學(xué)特性</p><p>　　桿狀病毒是一類雙鏈DNA病毒，其DNA是9.0×l04-2.3×105bp的環(huán)狀分子AcNPV和BmNPV的DNA分子為1.35×105bP左右[1]，病毒粒子呈桿狀，其感染宿主細(xì)用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白胞

23、后能夠產(chǎn)生兩種類型的病毒，一種是包涵型病毒(OV)，又稱多角體獲得病毒(PDV),另一種是芽生型病毒(BV)，或稱胞外病毒(ECV)。在感染的細(xì)胞核中，一部分核衣殼外形成囊膜，多角體或顆粒體蛋白沉積于囊膜上，形成包涵體病毒。另一部分核衣殼通過出芽的方式從細(xì)胞質(zhì)膜獲得囊膜，形成芽生型病毒。包涵體衍生的病毒主要進(jìn)行昆蟲之間的感染傳播，而芽生型病毒則負(fù)責(zé)昆蟲體內(nèi)感染的擴(kuò)散。包涵型病毒和芽生型病毒在基因組層次上完全一致，但由于囊膜獲得方式的不同

24、，其分子組成略有差別，主要是囊膜糖蛋白不同，芽生型病毒的糖蛋白為gp64，而包涵型病毒是gp41，由于糖蛋白在病毒識(shí)別受體和侵染細(xì)胞中起重要作用，因此包涵型病毒和芽生型病毒對(duì)不同組織細(xì)胞有不同感染力:包涵型病毒對(duì)腸中細(xì)胞感染力強(qiáng)，適于對(duì)昆蟲進(jìn)行喂食感染，而芽生型病毒對(duì)體腔中細(xì)胞感染力強(qiáng)，感染蟲體時(shí)須經(jīng)體腔注射。</p><p>　　二 桿狀病毒的基因工程原理</p><p>　　桿狀病毒體

25、外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立和完善，促進(jìn)了桿狀病毒分子生物學(xué)研究的巨大發(fā)展。桿狀病毒編碼的蛋白有二十多種，但其作為表達(dá)系統(tǒng)的主要吸引力源于其編碼的多角體蛋白基因，它在病毒感染的昆蟲細(xì)胞中，在復(fù)制循環(huán)的后期表達(dá)產(chǎn)生大量的多角體蛋白(28-30KD)，此蛋白在正常的感染循環(huán)中被用以將病毒粒子包裝在包涵體或多角體內(nèi)起保護(hù)作用，其含量占感染細(xì)胞蛋白總量的20-50%[2]，這一高比例在真核細(xì)胞中是相當(dāng)少見的。經(jīng)研究，多角體對(duì)于昆蟲口服感染是必需的，但對(duì)于在

26、體外細(xì)胞中維持病毒的感染是非必需的。通過多角體基因編碼區(qū)的缺失實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不產(chǎn)生多角體蛋白(Pn)并不影響培養(yǎng)細(xì)胞的感染性，非包涵粒子(ECV)在感染循環(huán)晚期形成。這樣，從邏輯上講，可用外源基因替代多角體基因編碼區(qū)，利用Pn啟動(dòng)子帶動(dòng)外源基因在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)。桿狀病毒基因工程最基本的途徑就是利用其Pn啟動(dòng)子帶動(dòng)目的基因，構(gòu)建含有目的基因表達(dá)結(jié)構(gòu)而缺失Pn基因編碼區(qū)的重組病毒，通過這種重組病毒感染昆蟲細(xì)胞或蟲體，獲得所需表達(dá)的蛋白。sm

27、ith等1983年首先發(fā)表了用AcNPv載體在Sf9中高效表達(dá)β-人干擾素的研究成果，接著Maedal985年</p><p>　　桿狀病毒的另一特點(diǎn)是基因組較大，具有多個(gè)天然啟動(dòng)子，也易于構(gòu)建新的人工啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)多基因表達(dá)。桿狀病毒除Pn啟動(dòng)子外還有PIO、PE、P6.9、ETL啟動(dòng)子，用于外源基因的表達(dá)，這些啟動(dòng)子的特點(diǎn)各不相同。P10基因與Pn基因一樣，與多角體形成有關(guān)，對(duì)病毒復(fù)制是非必需基因，用P10啟

28、動(dòng)表達(dá)外源基因，其表達(dá)水平與Pn啟動(dòng)子相當(dāng)。PE基因編碼的蛋白與多角體膜相連，也是病毒復(fù)制的非必需基因，但PE基因啟動(dòng)子表達(dá)水平僅為Pn、PIO啟動(dòng)子的1/50。P6.9基因啟動(dòng)子的表達(dá)水平也很高而且開始表達(dá)較早，但它是病毒復(fù)制的必需基因，Hill-perkins[3]等在多角體蛋白基因位置處復(fù)制了一個(gè)P6.9啟動(dòng)子用來帶動(dòng)外源基因，同時(shí)保持原P6.9基因不變，取得較好的表達(dá)效果。Thiem等構(gòu)建了一個(gè)融合啟動(dòng)子，含有P39基因啟動(dòng)子與

29、一部分Pn啟動(dòng)子，結(jié)果表達(dá)外源基因時(shí)，表達(dá)水平高。wang等根據(jù)晚期高效表達(dá)的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)了一個(gè)人工啟動(dòng)子，表達(dá)效果很好。從以上研究結(jié)果可以看出，桿狀病毒對(duì)外源基因的容量很大，可以同時(shí)插入多個(gè)外源基因。Emery和Bishop(1987)最早構(gòu)建了雙基因表達(dá)載體，用兩個(gè)P</p><p>　　多基因表達(dá)載體系統(tǒng)除了可以方便的表達(dá)外源基因外，還給病毒篩選和桿狀病毒載體基因工程疫苗的生產(chǎn)帶來方便。在多基因表達(dá)系統(tǒng)

30、中，可以用一個(gè)啟動(dòng)子帶動(dòng)表達(dá)報(bào)告基因(report gene)，如對(duì)β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。Vlak等構(gòu)建了用P10啟動(dòng)子帶動(dòng)外源基因，hsp70啟動(dòng)子帶動(dòng)β-半乳糖苷酶，Pn基因保持完整的重組病毒。該病毒感染細(xì)胞后，除表達(dá)外源基因外，還能很方便的篩選，同時(shí)能形成多角體，便于感染昆蟲蟲體[7-8]。</p><p>　　三 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展</p><p>　　桿狀病毒

31、發(fā)展成一種哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移載體昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的研究始于上世紀(jì)80年代，是繼大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)后建立起來的又一高效表達(dá)系統(tǒng)。目前用作表達(dá)載體的桿狀病毒均為核型多角體病毒，以苜蓿銀紋夜蛾多核衣殼核型多角體病毒和家蠶核型多角體病毒為代表。由于其宿主特異性，一般認(rèn)為該種高表達(dá)載體僅限于介導(dǎo)外源基因在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在非受納細(xì)胞中不能發(fā)揮作用。然而1983年，Volkman等。 發(fā)現(xiàn)AcNPV能夠侵入一些脊椎動(dòng)物細(xì)胞系

32、中，同年和次年，Groener和TjiaH 等也分別發(fā)表文章報(bào)道AcNPV可以侵入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此外，在上述三例報(bào)道中均未檢測(cè)到子代病毒產(chǎn)生，亦無病毒基因組復(fù)制表達(dá)。以上研究結(jié)果表明桿狀病毒可以侵入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但是其病毒基因組在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不能復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。這些研究為將桿狀病毒發(fā)展成為介導(dǎo)外源基因進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的新型基因轉(zhuǎn)移載體提供了理論依據(jù)[9-10]。</p><p>　　四 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性

33、</p><p>　?、贄U狀病毒的衣殼和基因組大，可容納10kb左右外源DNA，不影響復(fù)制，還可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)外源片段的表達(dá)；②應(yīng)用晚期蛋白啟動(dòng)子，即使外源基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性，也不影響表達(dá)水平，因?yàn)樵谕庠椿虮磉_(dá)之前，大部分病毒與宿主基因已被關(guān)閉，病毒已完成復(fù)制過程并釋放出大量成熟的子代病毒；③桿狀病毒具有明顯的宿主界限，對(duì)脊椎動(dòng)物無致病性，也不能在脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制表達(dá)，更不能整合，因此，重組桿狀病毒可以被認(rèn)為

34、是遺傳學(xué)上最安全的表達(dá)載體；④多角體蛋白與p10基因是非必需片段，啟動(dòng)子均很強(qiáng)，既為外源性片段提供插入位點(diǎn)，又可高水平表達(dá)外源基因，可稱為超高效表達(dá)系統(tǒng)；⑤外源基因插入多角體蛋白基因的座位引起后者的缺失或失活，無多角體蛋白形成，失去了病毒粒子天然保護(hù)物--多角體蛋白晶體，故重組病毒在自然環(huán)境下極易失活，不會(huì)造成對(duì)人的危害和對(duì)環(huán)境的污染，重組病毒不含包涵體，不在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，所以更為安全；⑥昆蟲細(xì)胞作為真核細(xì)胞能完成外源蛋白的一系列轉(zhuǎn)譯

35、后加工修飾，表達(dá)產(chǎn)物的理化和生物學(xué)特性與天然產(chǎn)物相似；⑦產(chǎn)量高，還能感染昆蟲活體，高效表達(dá)。⑧表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性，大多數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)后需在細(xì)胞中經(jīng)過一定的修飾加工，輸</p><p>　　五 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在HCV基因工程疫苗中的應(yīng)用前景</p><p>　　HCV核心抗體在丙型肝炎病人中是較早出現(xiàn)的抗體，而且滴度較高，因此在臨床檢測(cè)中具有重要的地位。研究表明，核心蛋白能激發(fā)宿主細(xì)胞的C

36、TL反應(yīng)，因而在宿主對(duì)病毒的消除方面有著一定的作用。HCV包膜蛋白區(qū)基因變異性大，其抗體尤其是E2抗體一直被認(rèn)為是具有潛在保護(hù)性的抗體。因此，近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)HCV結(jié)構(gòu)基因的研究相當(dāng)廣泛與深入，1991年Hijikata首先用體外翻譯的方法表達(dá)了HCV結(jié)構(gòu)蛋白，并對(duì)其組成加以分析，隨后，相繼有利用大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白的報(bào)道，對(duì)HCV結(jié)構(gòu)基因的切割、加工、尋找抗原表位、中和抗體的研究都起到相當(dāng)大的作用。原核系統(tǒng)表達(dá)

37、的HCV重組蛋白或合成肽抗原多為線性抗原，缺乏依賴于多膚折登或翻譯后加工才能形成的抗原表位。真核表達(dá)系統(tǒng)也存在細(xì)胞培養(yǎng)煩瑣，表達(dá)量不高的缺陷。</p><p>　　桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)其優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)人體安全、外源基因插入容量大、強(qiáng)大的多角體啟動(dòng)子啟動(dòng)高表達(dá)、產(chǎn)物具有生物活性，此外帶有外源基因的重組病毒可以直接感染昆蟲幼蟲并在體內(nèi)大量表達(dá)，表達(dá)量比細(xì)胞培養(yǎng)液高出幾十乃至上百倍，而幼蟲的大規(guī)模低成本的飼養(yǎng)大大降低了疫苗的制

38、備成本。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白能裝配成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)，這已在一些非包膜病毒如微小病毒、環(huán)狀病毒、杯狀病毒及包膜病毒如HCV等研究中得到證實(shí)。表達(dá)的蛋白能裝配成在形態(tài)上類似于野生病毒的空心顆粒，但顆粒內(nèi)部不含病毒核酸，其本身不能復(fù)制，因此使用安全，而且抗原性與野生病毒相同或相似，含有激發(fā)免疫反應(yīng)的各種復(fù)雜的免疫原。該抗原以顆粒形式存在，便于抗原提呈細(xì)胞捕獲，免疫后在體內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng)，

39、能更有效地刺激免疫系統(tǒng)，具有強(qiáng)大的免疫性。有資料表明，病毒樣顆粒疫苗具有長(zhǎng)期的保護(hù)作用，免疫效率高，其效果優(yōu)于滅活疫苗和減毒活疫苗。目前己在藍(lán)舌病毒、乳頭瘤病毒、人類免疫缺陷病毒、輪狀病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒等幾種病毒的顆粒疫苗制備、免疫活性研究中取得了理想的效果。隨著桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研究的進(jìn)一步深入和</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p&

40、gt;　　2.1細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒載體</p><p>　　2.1.1 Sf9細(xì)胞</p><p>　　由微生物教研室保存，在含有10%胎牛血清的Grace’S培養(yǎng)液中27℃培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿單層后，傾棄培養(yǎng)上清，加入適量的Grace’s完全培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打貼壁細(xì)胞使之完全脫落，混勻后分種至新瓶培養(yǎng)，通常一傳三，每三天傳代一次，用于重組桿狀病毒增殖和蛋白表達(dá)。</p><

41、;p>　　2.1.2 大腸桿菌</p><p>　　DH10Bac:為GIBCO/BRL公司產(chǎn)品，DH10Bac中含有穿梭載體Bacmid和輔助質(zhì)粒(helper Plasmid，含四環(huán)素抗性基因Tetr)，Bacmid上除含有AcNPv的全基因組外，還有一套轉(zhuǎn)座-穿梭盒，包括原核復(fù)制子miniF，卡那霉素抗性基因Kanr，β-半乳糖苷酶基因α片段(Lac Zα)，Tn7轉(zhuǎn)座子的接受位點(diǎn)att Tn7。輔助

42、質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)座酶使外源基因插入Bacmid的Tn7 att位置，并使Lac Z插入失活。</p><p>　　DH5α:由微生物教研室保存，用于質(zhì)粒的擴(kuò)增。</p><p><b>　　2.1.3 質(zhì)粒</b></p><p>　　pCV-J4:由微生物教研室保存，重組質(zhì)粒pCV-J4是田克隆載體pGEM-9ZF(一)插入HCV-J株基因組cD

43、NA構(gòu)建而成的，含有長(zhǎng)約9596bp的HCV全基因組cDNA，以此作為模板，用于PCR擴(kuò)增HCV結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因。</p><p>　　pFastBac1:為GIBCO/BRL公司產(chǎn)品，DNA長(zhǎng)4770bp，其中含有AcNPV的多角體啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)(MCS)，SV40 polyA終止信號(hào)，慶大霉素抗性基因(Gmr)和兩側(cè)翼的轉(zhuǎn)座子Tn7左右臂，外源基因可插入多克隆位點(diǎn)，通過轉(zhuǎn)座過程，表達(dá)盒整合到大腸桿菌中的Ba

44、cmid DNA上。</p><p>　　2.2 主要試劑及配制</p><p>　　2.2.1 分子生物學(xué)試劑</p><p>　　Expand Long Template enzyme mixture、10×Expand Long Template PCR buffer、dNTPs (10mmol/L)、Taq Plus DNA聚合酶為羅氏公司產(chǎn)品。各

45、種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶(5U/u1)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin均為GIBCO/BRL公司產(chǎn)品。質(zhì)粒抽提純化、PCR產(chǎn)物純化、小量膠回收等各種試劑盒均為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品。λDNA/EcoR I+HindⅢ marker為上海華美生物工程公司產(chǎn)品、PCR molecular marker為上海sangon公司產(chǎn)品、High molecular protein marker為上海華舜生物工程公司。</p&g

46、t;<p>　　2.2.2 生化試劑</p><p>　　四環(huán)素(Tet)使用終濃度10ug/ml，用無水乙醇溶解，濾膜過濾，分裝，-20℃保存，慶大霉素(Gm)使用終濃度7ug/ml、卡那霉素〔Kan)使用終濃度50ug/m1、氨節(jié)青霉素(Ap)使用終濃度100ug/ml，均用無菌水溶解，濾膜過濾，分裝，-20℃保存。磷酸鹽緩沖溶液(PBS):NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO41

47、.44g、KH2 PO4 0.24g，溶于800ml去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，加水定容至1L，15磅高壓蒸氣滅菌20min，室溫貯存。蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司。其它常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?lt;/p><p>　　2.3 培養(yǎng)液及培養(yǎng)基</p><p>　　2.3.1 LB培養(yǎng)液及LB平板</p><p>　　酵母提取物5.0g，胰蛋白胨10.

48、0g，NaCl 10.0g，溶于900ml去離子水中，用10MNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0--7.2，定容至1L，15磅高壓蒸氣滅菌20min，即為L(zhǎng)B培養(yǎng)液，貯存于4℃。按瓊脂粉終含量1.5%(W/V)的比例將瓊脂粉加入LB液體培養(yǎng)基，15磅高壓蒸氣滅菌20min，在無菌狀態(tài)下鋪制成LB平板，倒置平皿貯存于4℃?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.3.2 Grace，s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液</p><p&g

49、t;　　2.3.2.1 無血清無抗生素的Grace，s細(xì)胞培養(yǎng)液</p><p>　　Grace，s粉末2瓶(GIBCO/BRL公司產(chǎn)品) NaHCO3 0.7g、去離子水1800ml，用1mol/L Na0H調(diào)節(jié)pH至6.0，加去離子水定容至2000ml，正壓過濾除菌。分裝為兩部分:880ml作轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)用，貯存于-20℃；余下的1120ml配制成Grace，s完全細(xì)胞培養(yǎng)液。</p><p

50、>　　2.3.2.2 Grace，s完全細(xì)胞培養(yǎng)液</p><p>　　在1120ml無血清無抗生素的Grace，s細(xì)胞培養(yǎng)液中加入:50×水解乳蛋白(167g/L) 26ml、50×酵母抽提物(166g/L)26ml、10%胎牛血清FBS)130ml、鏈霉素(50ug/ml)1.3ml、青霉素(50ug/ml)1.3ml、分裝，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?lt;/p><p&g

51、t;　　2.4 堿法提取質(zhì)粒主要試劑</p><p>　　溶液I:50mmol/L葡萄塘，2mmol/LTris·Cl(pH8.0)，10mmol/EDTA(pH8.0),混勻后于15磅高壓蒸汽滅菌20min，貯存于4℃。</p><p>　　溶液Ⅱ:0.2mol/L NaOH，l%SDS，分別配置濃溶液貯存，臨用前稀釋。</p><p>　　溶液Ⅲ:5m

52、ol/L乙酸鉀60.0ml，冰乙酸11.5ml，雙蒸去離子水28.5ml。混勻后于15磅高壓蒸汽滅菌20min，貯存于4℃。</p><p>　　2.5 SDS--聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑</p><p>　　2.5.1 30%(W/V)聚丙烯酰胺溶液</p><p>　　丙烯酰胺30.0g、N，N--亞甲雙丙烯酞胺0.8g，去離子水溶解定容至100ml，過濾除菌，棕

53、色瓶貯存于4℃。</p><p>　　2.5.2聚丙烯酷胺凝膠電泳緩沖溶液</p><p>　　4×分離膠緩沖液:Tris堿18.17g、10% (W/V)SDS 4.0ml，用12N鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.8，去離子水溶解定容至100ml，室溫貯存。</p><p>　　4×積層膠緩沖液:Tris堿6.06g、10%SDS 4.0ml，用12N鹽酸調(diào)

54、節(jié)pH至6.8，去離子水溶解定容至100ml，室溫貯存。</p><p>　　2×蛋白樣品上樣緩沖液: 4×積層膠緩沖液25ml、10%SDS 2.0ml、甘油2.0ml、β-疏基乙醇0.5ml、0.1%溴酚蘭0.25ml，加去離子水定容至10ml，分裝成每管lml，4℃貯存。</p><p>　　10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液: Tris堿30.0g、10

55、%SDS100.0ml、甘氨酸144.0g，去離子水溶解定容至I000ml，用時(shí)10倍稀釋。</p><p>　　考馬斯亮藍(lán)R250染液:考馬斯亮藍(lán)R250 0.25g、甲醇45.0ml、冰乙酸10.0ml、去離子水45.0ml，用濾紙過濾，室溫貯存，可回收重復(fù)使用。</p><p>　　脫色液:甲醇45.0ml、冰乙酸45.0ml、無菌水10.0ml，室溫貯存。</p>&

56、lt;p>　　2.6 其它主要試劑</p><p>　　50×TAE(Tris-乙酸電泳緩沖液):Tris堿242.0g、冰乙酸57.lml、0.5mol/L EDTA(pH8.0) 100.0ml去離子水溶解定容至1000ml，用時(shí)50倍稀釋，配瓊脂糖凝膠時(shí)，每100ml加入5ul EB(溴化乙錠)。</p><p>　　蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移緩沖液:甘氨酸2.9g、Tris堿5.

57、8g、SDS0.37g、甲醇200.0ml，去離子水溶解定容至1000ml。</p><p><b>　　2.7 血清標(biāo)本</b></p><p>　　正常人對(duì)照血清43例，非肝炎病人血清樣本12例，經(jīng)RT-PCR確證為HCV RNA陽性的血清標(biāo)本15例，血清樣本由醫(yī)院血液科提供。</p><p><b>　　2.8 實(shí)驗(yàn)儀器<

58、/b></p><p>　　5145-C型臺(tái)式高速離心機(jī)〔德國(guó)Eppendorf公司)，PTC-100TM PCR儀(美國(guó)P.E公司)，SCR-300型電泳儀(浙江新安江生化儀器廠)，MA-110型電子分析天平(上海第二天平儀器廠)，WGP-300型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠)，CK4O倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，681型磁力加熱攪拌器(上海南匯電訊器材廠)，S-648型電熱恒溫水浴

59、箱(上海醫(yī)療器械七廠)，KLG-IV型冷凍干燥機(jī)(中科院科學(xué)儀器廠)，THZ-82型臺(tái)式恒溫振蕩器(太倉(cāng)市光明實(shí)驗(yàn)儀器廠)，ZF-A型紫外透射分析儀(上海長(zhǎng)明電子儀器廠)，TY-13型多用脫色搖床〔上海新波無線電廠)，蛋白電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)移電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)，SW-CJ-lF凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，101-2型干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠)，F(xiàn)R-200紫外與可見分析裝置即凝膠成像儀(上海復(fù)日科技有限公司)，微量移液器(德

60、國(guó)Eppendorf公司)。</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　3.1 引物合成及HCV結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(C-El-E2)基因片段的擴(kuò)增</p><p>　　3.1.1 引物設(shè)計(jì)</p><p>　　利用計(jì)算機(jī)GENERUNER程序設(shè)計(jì)擴(kuò)增HCV結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因的PCR引物</p>

61、<p>　　上游引物序列:5’—GCGCGAATTCACCATGAGCACGAATCC—3’； 27nt</p><p>　　為了達(dá)到定向克隆的目的，5’端加EcoR I酶切位點(diǎn)</p><p>　　下游引物序列:5’—GCGCAAGCTTCTAGGCGTAAGCTCGTGG—3’；28nt</p><p>　　為了達(dá)到定向克隆的目的，5’端加Hind

62、Ⅲ酶切位點(diǎn)</p><p>　　3.1.2 HCV結(jié)構(gòu)區(qū)基因的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的純化</p><p>　　以Pcv-J4質(zhì)粒為模板，利用Expand TM Long Template PCR system進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增HCV結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因片段(C-El-E2)。</p><p>　　反應(yīng)體系:總體積為50ul</p><p>　　Mix

63、2加入Mix1中，混勻后覆蓋30ul石蠟油，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性3min，94℃變性lmin，55℃退火1 min，68℃延伸2 min，循環(huán)30次，反應(yīng)結(jié)束時(shí)68℃延伸5min，迅速降溫至4℃。PCR產(chǎn)物于l%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。</p><p>　　當(dāng)證實(shí)PCR成功地?cái)U(kuò)增出C-El-E2(長(zhǎng)2.4kb)片段后，再按此程序進(jìn)行PCR反應(yīng)(擴(kuò)增4管，共200ul)，再次進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳

64、，然后回收純化。按DNA快速純化回收試劑盒說明書進(jìn)行操作，在紫外燈下切割下含有目的片段的瓊脂糖塊，使之盡可能小，放入1.5ml的Eppendorf 管中，按每100 mg瓊脂糖加入300ul溶膠液的比例，加入600ul的溶膠液，置55℃水浴10min，每2min顛倒混勻一次，使瓊脂糖塊完全溶化.加入200ul的異丙醇，混勻，55℃溫浴1min。移入吸附柱，12000g離心1min，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱

65、中加入450ul洗滌液，靜置1min，12000g離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱中加入450ul洗滌液，12000g離心15s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中.12000g離心1min.將吸附柱放入1.sml的Eppendorf管中，在吸附膜中央加入30ul洗脫液，靜置1min，12000g離心1min，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　3.2 重組轉(zhuǎn)座

66、載體的構(gòu)建</p><p>　　用EcoRⅠ和HindⅢ分別雙酶切目的基因和轉(zhuǎn)座載體pFastBac1質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳法回收純化，連接后轉(zhuǎn)化受體菌DH5α，選出同時(shí)抗慶大霉素(Gm)和抗氨芐青霉素(Amp)的重組子進(jìn)行酶切鑒定，得到含HCV結(jié)構(gòu)區(qū)基因的重組轉(zhuǎn)座載體，命名為pFB1-CEE。</p><p>　　3.2.1 酶切反應(yīng)</p><p>　　目的片段

67、(C-El-E2)的酶切:反應(yīng)體系:總體積為40ul，10×buffer 4ul，目的片段25ul，EcoRⅠ1 ul，HindⅢ 1ul，三蒸水9ul，反應(yīng)條件為37℃水浴2.5h。</p><p>　　轉(zhuǎn)座載體pFastBac1的醉切:反應(yīng)體系:總體積為40ul，10×buffer 4ul，質(zhì)粒pFastBac1 10ul，EcoRⅠ1ul，HindⅢ1ul，三蒸水24ul，反應(yīng)條件:37

68、℃水浴1.5h.</p><p>　　3.2.2. 目的片段(C-El-E2)及轉(zhuǎn)座載體pFastBac1的回收純化</p><p>　　將上述酶切的目的片段溶液和酶切的轉(zhuǎn)座載體pFastBac1分別進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行膠回收純化，得到純化的酶切目的片段和純化的線性轉(zhuǎn)座載體.</p><p>　　3.2.3 目的片段與轉(zhuǎn)座載體pFastBac1連接<

69、;/p><p>　　連接反應(yīng)體系:總體積為20ul，5×buffer 4.0ul，純化的目的片段12ul，純化的線性質(zhì)粒pFastBac1 3.0ul，T4DNA連接酶1.0ul(5U/ul)，將連接混合物放入17℃的保溫盒中，膠帶封口，過夜。</p><p>　　3.2.4 制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α及DH5α的轉(zhuǎn)化</p><p>　　3.2.5 重組轉(zhuǎn)座

70、載體pFB1-CEE的酶切鑒定</p><p>　　按堿法抽提純化質(zhì)粒，然后酶切鑒定所提質(zhì)粒:分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindⅢ以及EcoRV和HindⅢ來鑒定分析重組轉(zhuǎn)座載體pFB1-CEE。</p><p>　　反應(yīng)體系l:總體積為15ul，10×core buffer l.5ul，所提質(zhì)粒4.0ul，EcoRI 0.5ul，HindⅢ0.5ul，三蒸水8.5ul，反應(yīng)

71、條件:37℃水浴2h。</p><p>　　反應(yīng)體系2:總體積為15ul，10×core buffer l.5ul，所提質(zhì)粒4.0ul，EcoRV 0.5ul，HindⅢ0.5ul，三蒸水8.5ul，反應(yīng)條件:37℃水浴2h。</p><p>　　酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，將鑒定的陽性質(zhì)粒命名為pFB1-CEE。</p><p>　　3.3 重

72、組桿狀病毒穿梭載體的獲得</p><p>　　將pFB1-CEE轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(其中含有一個(gè)桿狀病毒穿梭載體簡(jiǎn)稱Bacmid，還有一個(gè)輔助質(zhì)粒)，以便獲得插入HCV結(jié)構(gòu)基因的重組桿狀病毒穿梭載體，稱為Bac-CEE。</p><p>　　3.3.1 制備三抗平板:三種抗生素終濃度為卡那霉素50ug/ml、慶大霉素7ug/ml和四環(huán)素10ug/ml。</p>

73、<p>　　3.3.2 制備感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac</p><p>　　3.3.3 重組pFB1-CEE轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac (轉(zhuǎn)座)</p><p>　　取2.5ul重組pFB1-CEE加入100ul感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac中，輕輕混勻，將離心管放入冰水浴30min。再置于42℃熱休克2min，然后迅速移至冰水中放置5min。在該管中加入滅菌的LB

74、液體培養(yǎng)基900ul，37℃搖床150r/min振蕩培養(yǎng)4h，使之發(fā)生轉(zhuǎn)座，pFB1-CEE質(zhì)粒中的多角體啟動(dòng)子及其下游的HCV結(jié)構(gòu)區(qū)基因表達(dá)盒通過轉(zhuǎn)座子Tn7的左右臂插入到Bacmid的LacZ中的接觸位點(diǎn)上(att Tn7)。6000g離心5min，棄上清，沉淀用新鮮的LB液體培養(yǎng)基以10-1、10-2，和10-3，不同的稀釋度稀釋，各取100ul分別涂布于含“三抗”的LB平板，這些平板提前30min己涂布100ug/ml X-ga

75、l和20ug/ml IPTG。將平皿于37℃倒置培養(yǎng)24～48h，觀察藍(lán)白斑的生長(zhǎng)情況。發(fā)生轉(zhuǎn)座后的DH10Bac細(xì)菌因其Lac Z基因被插入失活，而使含有重組Bacmid的大腸桿菌菌落成為白色。</p><p>　　3.3.4 重組桿狀病毒穿梭載體Bac-CEE DNA的提取</p><p>　　白色菌落的確證:用滅菌的牙簽隨機(jī)挑取5～10個(gè)分隔良好的白色菌落，再次接種于含“三抗”的平板

76、上，37℃倒置培養(yǎng)24h，觀察菌落表型的變化，如果所得菌落仍然均為白斑，說明所挑菌落均為真正含有整合了目的基因的Bac-CEE。</p><p>　　挑選仍為白斑的菌落接種于3ml含“三抗”的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床200r/min振蕩培養(yǎng)24h。將此培養(yǎng)液分裝至1.5ml的Eppendorf管中，12000g離心５min沉淀菌體。棄凈上清，加入300ul溶液I，重懸沉淀。加入300ul溶液I，溫和顛倒混勻，

77、室溫放置5min，使細(xì)菌裂解。緩慢逐滴加入300ul 3M(pH5.5)的乙酸鉀溶液，加入過程中輕微搖動(dòng)，置于冰上10min。14000g離心10min，同時(shí)標(biāo)好另一干凈的Eppendorf管，加入800ul異丙醉。輕輕將上清轉(zhuǎn)移至己加好異丙醇的新管中，注意不要混有蛋白沉淀，將離心管顛倒數(shù)次混勻，置于冰上10min。14000g離心15s，棄上清。分別用75%和100%的乙醇各洗滌一次，14000g離心5min。棄上清，風(fēng)干(在細(xì)胞室內(nèi)

78、無菌條件下)1h，溶于40ul無菌飛緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，l mmol/L EDTA，pH8.0)4℃短期保存或-20℃凍存。</p><p>　　3.4 重組桿狀穿梭載體病毒Bac-CEE的PCR鑒定</p><p>　　3.4.1 引物:引物采用PUC/M13(sangon公司)擴(kuò)增引物，此引物與Bacmid上的Tn7轉(zhuǎn)座子接受位點(diǎn)attTn7兩側(cè)的DNA相配對(duì)。

79、</p><p>　　引物I序列:5’—CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC—3’；24nt</p><p>　　引物11序列:5’ —AGCGGATAACAATTTCACACAGGA—3’；24nt</p><p>　　3.4.2 PCR反應(yīng):反應(yīng)體系:總體積為50ul，10×buffer 5ul，dNTPs lul，引物I 1ul，引物Ⅱ

80、1ul，模板1ul，Taq酶1ul，三蒸水40ul，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，首先在93℃預(yù)變性3min，再按94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸5min為循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min，速降溫至4℃。取15ul PCR產(chǎn)物于1%瓊脂塘凝膠電泳進(jìn)行分析。</p><p>　　3.5 重組桿狀病毒穿梭載體Bac-CEE轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞</p><p>　　3.5.1 轉(zhuǎn)染

81、Sf9單層細(xì)胞</p><p>　　用25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶(內(nèi)含2mlGrace’s完全培養(yǎng)液)培養(yǎng)的前一天傳代的Sf9單層細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)60%-70%時(shí)轉(zhuǎn)染。在無菌的Eppendorf管中配制以下溶液，A液:20ul重組Bac-CEE DNA加100ul無血清無抗生素的Grace’s培養(yǎng)液，B液:8ul脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin加l00ul無血清無抗生素Grace’s培養(yǎng)液，然后將A液和B液輕輕混合均

82、勻，37℃保溫放置30min。sf9單層細(xì)胞用無血清、無抗生素的Grace’s培養(yǎng)液洗滌三遍(以除去抗生素和胎牛血清，有利于Bac-CEE DNA進(jìn)入Sf9細(xì)胞)，棄凈溶液。在上述DNA混合液中補(bǔ)加800ul無血清、無抗生素的Grace’s培養(yǎng)液，至總體積約1ml，再吸入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于27℃孵育6h。6h后倒掉DNA混合物向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的完全Grace’s培養(yǎng)液3ml，27℃培養(yǎng)過夜，每天觀察細(xì)胞形態(tài)及病毒情況。

83、</p><p>　　3.5.2 重組桿狀病毒的收獲與保存</p><p>　　待轉(zhuǎn)染的Sf9單層細(xì)胞培養(yǎng)至第五天，Sf9細(xì)胞病變明顯，此時(shí)刮下細(xì)胞，1000g離心5min，收集含有重組桿狀病毒顆粒的培養(yǎng)上清液，將上清分成小份作為原毒種，-20℃保存，用于再次感染Sf9單層細(xì)胞以大量表達(dá)HCV結(jié)構(gòu)蛋白。</p><p>　　3.6 感染后Sf9細(xì)胞的收集</p

84、><p>　　用重組桿狀病毒感染Sf9單層細(xì)胞48h后收獲細(xì)胞，用彎頭吸管將培養(yǎng)瓶中貼壁的Sf9細(xì)胞輕輕刮下，轉(zhuǎn)移至Eppendorf 管中，1000g離心5min，棄上清，用lml PBS(0.01mol/L)洗滌細(xì)胞，Tip頭輕吹使細(xì)胞懸浮，1000g離心5min，倒凈PBS，每個(gè)Eppendorf中加入200ul無菌水，貯存于-20℃。</p><p>　　3.7 Sf9細(xì)胞表達(dá)的HCV

85、結(jié)構(gòu)蛋白的特性分析</p><p>　　3.7.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析</p><p>　　配制12.5%的分離膠溶液和5%的積層膠溶液。取50ul上述(3.6中)收集的Sf9細(xì)胞，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻后將樣品置于100℃沸水浴5min，以使蛋白質(zhì)裂解變性，正常的Sf9單層細(xì)胞作為對(duì)照組做同樣處理。將重組桿狀穿梭載體病毒Bac-CEE感染的Sf9細(xì)胞

86、裂解液、高分子量蛋白marker、正常的sf9細(xì)胞裂解液，加入點(diǎn)樣孔，每孔上樣20ul，先用50V恒定電壓電泳，當(dāng)溴酚蘭指示劑進(jìn)入分離膠后，提高電壓至100V繼續(xù)恒定電壓電泳，直至溴酚蘭帶遷移到達(dá)分離膠底部1cm左右，關(guān)閉電源，卸下玻璃板，取出凝膠，置于2%考馬斯亮蘭R-250染色液中，放于脫色搖床上平緩搖動(dòng)，室溫染色4h以上，移出凝膠并回收染色液，將凝膠浸泡于脫色液中，平緩搖動(dòng)脫色8h，其間更換脫色液數(shù)次，脫色至背景清晰。</p

87、><p>　　3.7.2 表達(dá)蛋白的抗原性初步測(cè)定</p><p>　　用手術(shù)刀片將SDS-聚丙烯酰胺凝膠上可見的特異性表達(dá)條帶切下，搗碎后用PBS做1:1000稀釋，然后包被聚丙乙烯塑料條排孔，置冰箱4℃過夜后，用間接ELISA法檢測(cè)保存的各類血清標(biāo)本。</p><p><b>　　4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　

88、　4.1 HCV結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(C-El-E2)基因片段的PCR擴(kuò)增</p><p>　　以pCV-J4質(zhì)粒作為模板，將此模板分別作1:10、l:100、l:1000稀釋后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物各取20ul上樣，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，所得基因片段大小與C-El-E2大小一致(2.4kb)，證實(shí)克隆的基因片段為HCV的結(jié)構(gòu)區(qū)基因片段，同時(shí)可以看出pCV-J4模板進(jìn)行l(wèi):1000稀釋后擴(kuò)增的條帶效果最好。<

89、/p><p>　　圖1 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳</p><p><b>　　1：無模板對(duì)照</b></p><p>　　2：PCR 模板1:10稀釋</p><p>　　3：PCR 模板1:100稀釋</p><p>　　4：PCR 模板1:1000稀釋</p><p>　　M

90、: ΛDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker</p><p>　　4.2 重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建</p><p>　　轉(zhuǎn)座載體pFastBac1質(zhì)粒用EcoRI和HindⅢ雙酶切后回收4.7kb的線性化質(zhì)粒，目的片段因其兩端有EcoRI和HindⅢ酶切位點(diǎn)，因而也同樣進(jìn)行雙酶切，純化后的目的片段與線性化的質(zhì)粒在T4DNA連接酶的作用下構(gòu)成7.1 kb的含HCV結(jié)構(gòu)區(qū)基因的重組轉(zhuǎn)座載體pF

91、B1-CEE。轉(zhuǎn)化涂布于含慶人霉素和氨節(jié)青霉素的LB平板上，篩選得到重組克隆。</p><p>　　圖2重組轉(zhuǎn)座載體pFB1-CEE構(gòu)建 </p><p>　　4.3 重組轉(zhuǎn)座載體pFB1-CEE的酶切分析</p><p>　　為了鑒定所挑選的重組克隆，根據(jù)圖譜進(jìn)行多種限制性內(nèi)切酶的酶切分析，結(jié)果表明重組質(zhì)粒大小與預(yù)期大小一致，用EcoRI和HindⅢ雙酶切后，釋放

92、2.4kb左右的目的片段，用EcoRV和HindⅢ雙酶切后，出現(xiàn)了3.7kb和3.5kb的條帶，顯示了其插入方向的正確性，因此得到了正確的重組轉(zhuǎn)座載體。由于lane2中的兩條帶相差200約bp，在電泳中兩帶相互重合在一起，需要電泳更長(zhǎng)時(shí)間或加大瓊脂糖凝膠濃度才可能拉開。</p><p>　　圖3 重組轉(zhuǎn)座載體pFB1-CEE酶切鑒定</p><p>　　1：EcoR I+ HindⅢ（4.

93、7kb+2.4kb）</p><p>　　2: EcoR V+ HindⅢ（3.7kb+3.5kb）</p><p>　　3：pFB1-CEE（7.1kb）</p><p>　　M: ΛDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker</p><p>　　4.4 重組桿狀病毒的獲取</p><p>　　用重組轉(zhuǎn)座載體pFB

94、1-CEE轉(zhuǎn)化DH10Bac人腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48h，在細(xì)胞內(nèi)輔助質(zhì)粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶的幫助卜，pFB1-CEE上的表達(dá)盒轉(zhuǎn)座到細(xì)胞內(nèi)Bacmid上的轉(zhuǎn)座子接受位點(diǎn)att Tn7，形成重組的Bacmid，此時(shí)LacZ基因被插入失活，而使攜帶重組Bacmid的大腸桿菌菌落在X-gal和IPTG選擇培養(yǎng)基上旱自色菌落，而未發(fā)生轉(zhuǎn)座的菌落為藍(lán)色，自色克隆可能為含有重組Bacmid的克隆，挑選自色克降進(jìn)行重組Bacmid的提取純化得到的

95、重組Bacmid稱之為Bac-CEE。</p><p>　　4.5 重組桿狀病毒Bac-CEE的鑒定</p><p>　　采用PCR的方法來鑒定表達(dá)盒是否插入到Bacmid記之中，如果轉(zhuǎn)座成功則PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為4679bp(包含目的基因2426bp、Tn7轉(zhuǎn)座子左右臂之間長(zhǎng)1980bp、引物間長(zhǎng)273bP)反之轉(zhuǎn)座不成功，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小只有引物間長(zhǎng)度273bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊

96、脂糖凝膠電泳，可見4679bp的片段，證實(shí)重組桿狀病毒Bac-CEE構(gòu)建成功。</p><p>　　圖4：PCR鑒定重組桿狀病毒Bac-CEE</p><p>　　1-3：Bac-CEE(4.6kb)</p><p>　　M: ΛDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker</p><p><b>　　4：空白對(duì)照</b>

97、;</p><p>　　4.6 正常Sf9細(xì)胞形態(tài)和Bac-CEE轉(zhuǎn)染后Sf9細(xì)胞的形態(tài)變化</p><p>　　在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin的幫助下，重組桿狀病毒Bac-CEE轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染后，形態(tài)逐漸發(fā)生改變，至第五天時(shí)，倒置顯微鏡下可見Sf9細(xì)胞變大、變圓，胞漿內(nèi)出現(xiàn)許多折光性很強(qiáng)的顆粒，細(xì)胞內(nèi)緊密連接消失，細(xì)胞逐漸破碎脫落，而正常細(xì)胞則無這種變化，

98、說明轉(zhuǎn)染成功，此時(shí)收集的培養(yǎng)上清液，即含有大量的重組桿狀病毒。</p><p>　　圖5 正常Sf9細(xì)胞 圖6 Bac-CEE轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞</p><p>　　4.7 重組蛋白的SDS-PAGE分析</p><p>　　將所收集的重組桿狀病毒Bac-CEE感染Sf9單層細(xì)胞，收獲的細(xì)胞裂解后進(jìn)行12.5%的SDS-聚

99、丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，在聚丙烯酰胺凝膠上出現(xiàn)一條特異的蛋白條帶，大小介于97KD與116KD之間，比理論值91KD略大，是因?yàn)樵摰鞍自诶ハx細(xì)胞中得到了糖基化，而對(duì)照的止常Sf9細(xì)胞未見此蛋白帶。在培養(yǎng)的上清液中未見此蛋白帶，說明HCV結(jié)構(gòu)蛋白土要存在于胞漿內(nèi)，其表達(dá)是不分泌的。此結(jié)果證實(shí)HCV結(jié)構(gòu)蛋白基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中得到了高水平的表達(dá)。</p><p>　　圖7 表達(dá)蛋白的SDS-

100、PAGE</p><p>　　1： 正常的Sf9細(xì)胞</p><p>　　2-3：被重組病毒感染的Sf9細(xì)胞</p><p>　　M: 超高分子量蛋白質(zhì)標(biāo)記</p><p>　　4.8 表達(dá)蛋白的抗原性檢測(cè)</p><p>　　用表達(dá)蛋白包被條排孔，采用間接ELISA法共檢測(cè)了70份不同類型的血清標(biāo)本。43例止常人對(duì)照

101、血清出現(xiàn)陽性2例，12份非肝炎病人血清樣本出現(xiàn)陽性l例，15份經(jīng)RT-PCR確證為HCV RNA陽性的血清標(biāo)本，該ELISA檢測(cè)出現(xiàn)陽性13例，陽性率達(dá)到87%，初步顯示表達(dá)的蛋白具有一定的抗原性，為丙型肝炎試劑盒的制備以及肝炎疫苗的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。</p><p><b>　　5 結(jié)論</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)利用PCR擴(kuò)增HCV結(jié)構(gòu)區(qū)基因，克隆到桿

102、狀病毒表達(dá)載體pFastBac1中，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座載體pFB1-CEE，轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌落，抽提大分子質(zhì)粒DNA，獲得含HCV結(jié)構(gòu)區(qū)基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bac-CEE，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收集含有重組桿狀病毒顆粒的培養(yǎng)上清，重新感染Sf9細(xì)胞，利用SDS-PAGE方法分析重組蛋白，獲得了昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的HCV重組結(jié)構(gòu)蛋白，為進(jìn)一步研制適用于人的HCV預(yù)防性疫苗打下工作基礎(chǔ)。

103、</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]許信剛，童德文. 桿狀病毒表面展示系統(tǒng)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009（08）。 </p><p>　　[2]李志勇，殷相平等. 桿狀病毒/哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移載體應(yīng)用于活載體疫苗研究的進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2010（0

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