人胃賁門腺癌組織和正常胃黏膜組織蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的差異分析[001]

1、<p>　　人胃賁門腺癌組織和正常胃黏膜組織蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的差異分析</p><p>　　劉國紅，楊繼要，呼 琳，張欽憲★ （鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，鄭州，450052） </p><p>　　關(guān)鍵詞 蛋白質(zhì)組學(xué);雙向電泳;賁門腺癌 </p><p>　　中圖分類號(hào) R 735.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A </p><p&

2、gt;　　賁門癌(Gastric cardia adenocarcinoma，GCA)是我國北方常見的惡性腫瘤之一,其最顯著的流行病學(xué)特征是與食管癌地域分布的一致性。在食管癌高發(fā)區(qū)河南省林州市及其相鄰地區(qū),賁門癌與食管癌發(fā)病率之比為1∶3.2,并且預(yù)后極差[1],目前仍然是該地區(qū)腫瘤相關(guān)主要死亡原因。目前GCA發(fā)病機(jī)制尚不明確，關(guān)于GCA的蛋白質(zhì)組學(xué)研究少見報(bào)道。隨著雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析等蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)的迅猛發(fā)展，從蛋白質(zhì)組整體水

3、平研究腫瘤已成為可能。本研究采用雙向電泳技術(shù)分離賁門腺癌與正常胃黏膜組織總蛋白，獲得兩組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，通過Imagemaster6.0軟件分析，尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì)，以期從蛋白質(zhì)組整體水平研究賁門腺癌發(fā)生、演變過程中蛋白質(zhì)表達(dá)變化，為闡明賁門腺癌發(fā)病分子機(jī)制、篩選早期診斷的特異性指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>&

4、lt;b>　　1.1 標(biāo)本</b></p><p>　　8例賁門腺癌標(biāo)本取自鄭州大學(xué)一附院手術(shù)患者，男性6例，女性2例。正常胃黏膜取自距賁門腺癌組織邊緣5cm以外部位，病理確認(rèn)無增生和癌變。</p><p>　　1.2 主要試劑和儀器</p><p>　　pH 3～10、11cm線性IPG膠條、尿素、硫脲、CHAPS、DTT、碘乙酰銨、丙烯酰胺、甲

5、叉雙丙烯酰胺、硫代硫酸鈉、硝酸銀、EDTA、低熔點(diǎn)瓊脂糖；PROTEIN IEF CELL 等電聚焦儀、PROTEAN Iixi cell電泳儀、magicscan圖像獲取儀、Imagemaster6.0凝膠圖像分析軟件。 </p><p><b>　　1.4 方法</b></p><p>　　1.4.1 組織蛋白提取和定量</p><p>　

6、　取賁門腺癌或胃黏膜組織100mg剪碎，移入勻漿器，加入1ml組織裂解液于冰上勻漿，室溫靜置30min，轉(zhuǎn)入1.5mlEP管，冰上超聲破碎5 min。15000g離心30min,取上清再離心20min,取上清即為組織總蛋白，BrandFord法測蛋白濃度，分裝，-80℃保存。</p><p>　　1.4.2 雙向電泳（2-DE）</p><p>　　第1向等電聚焦電泳：參考PROTEIN

7、IEF CELL 等電聚焦儀操作指南進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)采用11cm線性PH3～10IPG膠條，蛋白上樣量100µg，水化上樣總體積200µl。第2向垂直電泳：膠條平衡后轉(zhuǎn)入12.5%SDS-PAGE分離膠，PROTEAN Iixi cell電泳儀上進(jìn)行垂直電泳。</p><p>　　1.4.3凝膠銀染、圖像掃描和分析</p><p>　　凝膠銀染后magicscan掃描儀獲取

8、2-DE圖像，Imagemaster6.0軟件分析。蛋白質(zhì)點(diǎn)變化（以vol%表示）[2]在賁門腺癌和胃黏膜間增多或減少2倍以上認(rèn)定表達(dá)有差異。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　經(jīng)雙向電泳獲得了蛋白斑點(diǎn)清晰、重復(fù)性好的賁門腺癌和正常胃黏膜2-DE圖譜（圖1）。經(jīng)Imagemaster6.0軟件分析，蛋白主要分布在PI 4～7、相對(duì)分子質(zhì)

9、量（20～90）×103范圍內(nèi)，賁門腺癌組平均蛋白點(diǎn)數(shù)843±29個(gè)，平均匹配率76.9%。胃黏膜組平均蛋白點(diǎn)數(shù)827±36,平均匹配率80.3%。兩組間有47個(gè)差異表達(dá)蛋白，29個(gè)在癌組織高表達(dá)，18個(gè)低表達(dá)（圖2）。</p><p><b>　　A B</b></p><p>　　圖1 賁門腺癌組織(A)與胃黏膜組織（B）

10、2-DE圖譜</p><p>　　圖2 賁門腺癌(A)與胃黏膜組織(B)2-DE圖譜部分差異蛋白點(diǎn)放大圖</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　賁門癌是指發(fā)生于食管賁門接合線以下2cm、鱗狀上皮和腺上皮交界區(qū)的胃賁門部的癌。近30年來,賁門癌的發(fā)生率呈穩(wěn)定上升趨勢,而胃遠(yuǎn)端腫瘤卻明顯下降。賁門癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,可

11、能與Barrett食管、賁門部腸化生、幽門螺桿菌、胃食管反流性疾病等因素相關(guān)[3]。因解剖位置的關(guān)系，賁門癌在發(fā)病情況、臨床癥狀、病理特征和治療方面都有其特殊性。此種特殊病種,診斷容易延誤,惡性程度高,以致療效欠佳,已引起臨床關(guān)注。</p><p>　　腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以動(dòng)態(tài)、整體、定量檢測腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變[4]，從蛋白質(zhì)組整體水平比較腫瘤組織/細(xì)胞與正常組織/細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異

12、，可從中發(fā)現(xiàn)腫瘤診斷、預(yù)后和治療的分子標(biāo)志。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)癌癥相關(guān)蛋白進(jìn)行篩選和鑒定，為發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物提供了新方法[5]。2-DE技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分離蛋白質(zhì)的主要技術(shù)[6]，相同條件下利用2-DE技術(shù)分離賁門腺癌和正常胃黏膜組織蛋白，獲得分辨率高、重復(fù)性好的2-DE圖譜，是篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。本研究以賁門腺癌組織為研究對(duì)象，對(duì)2-DE技術(shù)的程序及有關(guān)環(huán)節(jié)（如樣品處理、電泳參數(shù)和上樣量）進(jìn)行反復(fù)改進(jìn)和優(yōu)

13、化，初步建立了一套適合賁門腺癌蛋白質(zhì)組研究的方法。</p><p>　　作者對(duì)8例賁門腺癌和胃黏膜組織總蛋白進(jìn)行雙向電泳分離，獲得的2-DE圖譜分辨率高、蛋白點(diǎn)位置重復(fù)性好，組間具有很好的可比性。通過Imagemaster6.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測和匹配分析，發(fā)現(xiàn)賁門腺癌和胃黏膜組織蛋白點(diǎn)多在PI 4～7，相對(duì)分子質(zhì)量（20～90）×103范圍內(nèi)，以蛋白質(zhì)斑點(diǎn)變化2倍以上為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出47個(gè)差異表達(dá)蛋

14、白點(diǎn)。由于本實(shí)驗(yàn)是以賁門腺癌和配對(duì)胃黏膜為研究對(duì)象，因此篩選出的差異表達(dá)蛋白均可認(rèn)為與賁門腺癌的發(fā)生相關(guān)，這為進(jìn)一步篩選鑒定賁門腺癌相關(guān)蛋白、闡明賁門腺癌發(fā)生的分子機(jī)制提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1]Powell J,McConkey C C.Increasing incidence of adeno

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