紅細(xì)胞檢驗(yàn)的基礎(chǔ)

1、紅細(xì)胞檢驗(yàn)的基礎(chǔ)理論,南昌大學(xué)一附院檢驗(yàn)科 呂小林,紅細(xì)胞檢驗(yàn)的基礎(chǔ)理論,紅細(xì)胞膜血紅蛋白紅細(xì)胞代謝紅細(xì)胞的衰老和死亡,紅細(xì)胞膜,一、紅細(xì)胞膜的組成與結(jié)構(gòu)二、紅細(xì)胞膜的功能三、影響紅細(xì)胞膜穩(wěn)定的因素,細(xì)胞膜的化學(xué)組成,細(xì)胞膜,,膜脂,膜蛋白,,磷脂,膽固醇,,卵磷脂（磷脂酰膽堿）,腦磷脂（磷脂酰乙醇胺）,鞘脂（帶一個(gè)氨基）,糖脂（ABO血型）,,外周蛋白和整合蛋白,運(yùn)輸?shù)鞍?、受體蛋白和酶,糖類,紅細(xì)胞膜脂質(zhì)組成,,人紅細(xì)

2、胞膜的主要蛋白,,E.Gorter and F. Grendel Model, 1925,,結(jié)構(gòu),紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)示意圖,有關(guān)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的幾個(gè),紅細(xì)胞膜骨架結(jié)構(gòu)：膜下0.2ul膠溶層，包括主體蛋白和外周蛋白主體蛋白：鑲嵌于脂質(zhì)雙層中，多屬糖蛋白外周蛋白：與脂質(zhì)雙層疏松結(jié)合，易被水解血影（ghost）：RBC裂解釋放Hb后留下一個(gè)保留原形的空殼結(jié)構(gòu),,概念,細(xì)胞膜的化學(xué)結(jié)構(gòu),,,,外周蛋白,,膜骨架,主體蛋白,紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)示意圖,紅

3、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)示意圖,,膜骨架功能,維持紅細(xì)胞的正常形態(tài)及變形性,膜結(jié)構(gòu)最基本的特征,細(xì)胞膜的不對(duì)稱性細(xì)胞膜的流動(dòng)性,細(xì)胞膜的不對(duì)稱性,膜脂的不對(duì)稱性膜蛋白的不對(duì)稱性（功能上的方向性不對(duì)稱）復(fù)合糖的不對(duì)稱性,細(xì)胞膜的不對(duì)稱性是生物膜完成復(fù)雜的在時(shí)間與空間上有序的各種生理功能的保證,膜脂質(zhì)不對(duì)稱性,外小頁(yè)：PC（膽堿磷脂）、PM（鞘磷脂）內(nèi)小頁(yè)：PE（乙醇胺磷脂）、PS（絲氨酸磷脂）與細(xì)胞老化、調(diào)亡、細(xì)胞識(shí)別和吞飲有關(guān),膜蛋

4、白不對(duì)稱性,特性：具有明顯方向性和區(qū)域性蛋白激酶C 磷脂酰絲氨酸（內(nèi)小頁(yè)）,,,復(fù)合糖不對(duì)稱性,特性：糖蛋白、糖脂僅分布于細(xì)胞外側(cè)意義：細(xì)胞表面受體、與細(xì)胞抗原性有關(guān),細(xì)胞膜的不對(duì)稱性示意圖,膜流動(dòng)性,主要指脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng) 脂質(zhì) 液態(tài) 晶態(tài) 蛋白質(zhì) 側(cè)向運(yùn)動(dòng)、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)生理意義：保證細(xì)胞生理功能必要條件,,,研

5、究膜蛋白流動(dòng)性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn),,二、細(xì)胞膜的生物學(xué)功能,為細(xì)胞生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境選擇性的物質(zhì)運(yùn)輸，其中伴隨能量的傳遞提供細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，完成信息傳遞提供多種酶結(jié)合位點(diǎn)，使酶促反應(yīng)高效進(jìn)行介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接參與形成具有不同功能的細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu),膜功能一、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境,一、屏障作用二、賦予高度變性能力,膜功能二、物質(zhì)跨膜運(yùn)輸,簡(jiǎn)單擴(kuò)散協(xié)助擴(kuò)散主動(dòng)運(yùn)輸（由ATP直接提供能量，如：鈉鉀泵和質(zhì)子泵；間接由

6、ATP提供能量，如：協(xié)同運(yùn)輸）基團(tuán)轉(zhuǎn)移內(nèi)吞和外排,,膜功能三、細(xì)胞識(shí)別及信息傳遞,細(xì)胞識(shí)別：與寡糖鏈密切相關(guān)1、血型抗原2、補(bǔ)體受體（CRI）,二、影響紅細(xì)胞膜穩(wěn)定因素,化學(xué)因素,影響膜穩(wěn)定和因素,免疫因素,紅細(xì)胞膜蛋白的遺傳性缺陷,酶代謝異常,ATP生成不足,,生物因素,,第二節(jié)血紅蛋白,血紅蛋白,血紅蛋白組成血紅蛋白結(jié)構(gòu)、功能血紅蛋白種類影響血紅蛋白結(jié)構(gòu)、功能因素,血紅蛋白組成,血紅素：鐵原子、原卟啉Ⅸ

7、珠蛋白,血紅蛋白,血紅蛋白結(jié)構(gòu)與功能,結(jié)構(gòu)：二條α鏈和二條β鏈 緊密型（T）、松弛型（R）功能：運(yùn)輸氧，具有協(xié)同效應(yīng),生理性血紅蛋白種類,胚胎期：成人：,影響血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能的因素,珠蛋白基因缺失或缺陷 Heinz酶缺陷 MHb化學(xué)藥物中毒 MHb、SHb、HbCO,第三節(jié) 紅細(xì)胞代謝,紅細(xì)胞糖代謝鐵代謝核苷酸代謝,紅細(xì)胞

8、糖代謝,葡萄糖無(wú)氧酵解磷酸戊糖途徑與谷胱甘肽途徑其它,葡萄糖無(wú)氧酵解,無(wú)氧酵解 獲取能量唯一途徑2、3二磷酸甘油酸代謝支路 影響血紅蛋白與氧親和力酶缺乏 丙酮酸激酶,磷酸戊糖途徑與谷胱甘肽途徑,磷酸戊糖途徑：還原性輔酶Ⅱ（NADPH）、磷酸核糖（參與嘌呤、ATP合成）谷胱甘肽途徑：保護(hù)-SH基團(tuán)、降解H2O2酶缺乏：G6PD,鐵代謝 鐵的運(yùn)轉(zhuǎn),,鐵的貯存,紅細(xì)胞核苷酸代謝,維生素B12和葉酸的

9、來(lái)源與吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、利用與貯存在合成DNA中作用影響吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)因素,紅細(xì)胞核苷酸代謝,葉酸的吸收,葉酸,蝶酰單谷氨酸,四氫葉酸,雙氫葉酸還原酶,多谷氨酸鹽,參與DNA合成,組織細(xì)胞酶促作用下,,血漿,,,,,,,葉酸進(jìn)入組織細(xì)胞后，轉(zhuǎn)變?yōu)槎喙劝彼猁}，才具有 參與DNA合成的活性。葉酸吸收障礙后2~7個(gè)月內(nèi)導(dǎo)致葉酸缺乏，也引起與vitB12缺乏時(shí)相似的巨 幼紅細(xì)胞性貧血。 葉酸的活化需要vitB12參與，因此，vitB12缺乏時(shí)，

10、葉酸的利用率下降，可引起葉酸相對(duì)不足。,胃液,小腸上段,回腸,門脈血流,肝,轉(zhuǎn)鈷蛋白II造血組織,B12與R蛋白結(jié)合,胰蛋白酶斷裂結(jié)合。與內(nèi)因子結(jié)合，免被蛋白水解酶破壞。,內(nèi)因子一部分與B12結(jié)合，一部分與回腸上皮細(xì)胞膜特異受體結(jié)合，被吸收,,,,,,* 內(nèi)因子胃腺壁細(xì)胞分泌的一種糖蛋白 R蛋白是一種電泳速度很快的血漿蛋白。** B12吸收障礙，巨幼R(shí)BC性貧血---大細(xì)胞性貧血,Vit.B12吸收,紅細(xì)胞的衰老

11、和死亡,1、紅細(xì)胞糖代謝改變2、紅細(xì)胞膜及血紅蛋白改變,3、紅細(xì)胞的破壞,紅細(xì)胞平均壽命120天，在血管內(nèi)循環(huán)流動(dòng)約27KM，在穿過(guò)小血管和孔隙時(shí)可變形而不至于破裂。衰老紅細(xì)胞脆性增加，易破裂，通過(guò)微小孔隙也發(fā)生困難，容易停滯于脾和骨髓中被巨噬細(xì)胞所吞噬。,細(xì)胞的衰老：,未分化,,分化,,衰老,,死亡,衰老是一種正常的生命現(xiàn)象,生物體內(nèi)的絕大多數(shù)細(xì)胞，都有經(jīng)過(guò)未分化、分化、衰老、死亡這幾個(gè)階段。,紅細(xì)胞的死亡,紅細(xì)胞的消亡無(wú)效

12、造血,紅細(xì)胞檢驗(yàn)的基本方法,一附院 呂小林,紅細(xì)胞檢驗(yàn)的基本方法,有關(guān)鐵指標(biāo)的檢驗(yàn)血清和紅細(xì)胞葉酸測(cè)定溶血的檢驗(yàn)紅細(xì)胞膜缺陷的檢驗(yàn)紅細(xì)胞酶缺陷的檢驗(yàn)血紅蛋白異常的檢驗(yàn)免疫性溶血貧血的檢驗(yàn),血清鐵測(cè)定,原理：Fe2+ Fe +3 +顯色劑，生成有色絡(luò)合物。應(yīng)用評(píng)價(jià)1、降低：需求量增加、IDA、慢性失血和 感染等。2、增高：肝疾病、鐵粒幼

13、細(xì)胞貧血、AA、 慢性溶血、反復(fù)輸血等3、血清經(jīng)常變化，單項(xiàng)檢測(cè)意義不大。,,血清鐵蛋白測(cè)定,原理：固相放射免疫法。兔抗人鐵蛋白+血清鐵蛋白 Ag-Ab復(fù)合物+125I標(biāo)記Ab 標(biāo)記Ab-Ag-Ab，檢測(cè)復(fù)合物中放射性 算出血清鐵蛋白值應(yīng)用：能準(zhǔn)確反映體內(nèi)儲(chǔ)鐵情況。SF減少是診斷IDA敏感方法之一。1、降

14、低：IDA、慢性失血和 貧血等。 2、增高：肝疾病、鐵代謝障礙性貧血、感染、 惡性腫瘤等,,,血清總鐵結(jié)合力測(cè)定,原理：在血清中加入已知過(guò)量的鐵標(biāo)準(zhǔn)液，使之飽和，并檢測(cè)其中鐵，即總鐵結(jié)合力。再減去原血清轉(zhuǎn)鐵蛋白中所含的鐵，為未飽和鐵結(jié)合力應(yīng)用：增高 IDA和真紅細(xì)胞增多癥等。 降低或正常 肝疾病、溶血性貧

15、 血、感染、惡性腫瘤和腎病綜合征等,,小細(xì)胞低色素性貧血的實(shí)驗(yàn)鑒別,鐵檢驗(yàn),鐵檢驗(yàn),IDA紅細(xì)胞掃描電鏡圖像：,,缺鐵性貧血血象：,,IDA紅細(xì)胞形態(tài),IDA紅細(xì)胞,正常紅細(xì)胞,IDA骨髓病理 正常骨髓外鐵外鐵（-）~（±）： （+）~（++）：,,細(xì)胞內(nèi)鐵,,第二節(jié) 葉酸和維生素B12的檢測(cè),一、葉酸測(cè)定 放射免疫法二、維生素B12測(cè)定 放

16、射免疫法三、應(yīng)用評(píng)價(jià) 1、降低：巨幼細(xì)胞貧血 2、增高：白血病，某些惡性腫瘤等,巨幼細(xì)胞貧血血象,,巨幼細(xì)胞貧血骨髓象,,巨幼細(xì)胞貧血骨髓象,,第三節(jié)溶血的檢驗(yàn),紅細(xì)胞壽命測(cè)定血漿游離血紅蛋白檢測(cè)血清結(jié)合珠蛋白檢測(cè)尿含鐵血黃素檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)室檢查,一、RBC壽命測(cè)定（最佳） 51Cr同位素標(biāo)記正常值：25~32天應(yīng)用評(píng)價(jià) 1、溶血性貧血 紅細(xì)胞壽命縮短，約14天 2、再生障礙性貧血 約15-29天,紅細(xì)

17、胞碎片,,血漿游離血紅蛋白檢測(cè),原理 利用HB具有過(guò)氧化物酶活性，采用過(guò)氧化物酶法檢測(cè)血漿游離血紅蛋白。參考值 0-40mg/L臨床評(píng)價(jià) 1、判斷血管內(nèi)溶血 PNH、蠶豆病、溶血反應(yīng)等明顯增高，自身免疫性貧血、珠蛋白障礙性貧血可輕到中度增高。 2、血管外溶血不增高,溶血的檢驗(yàn),血清結(jié)合珠蛋白檢測(cè),原理 血清結(jié)合珠蛋白測(cè)定是在待測(cè)血清中加入一定量的血紅蛋白液，使之與測(cè)血清中的HP形成HP-HB復(fù)合物。通過(guò)電泳

18、法分離復(fù)合物，并測(cè)定其量，從而算出結(jié)合珠蛋白的量。參考值 0.5-1.5gHB/L臨床評(píng)價(jià) 1、減低 常見(jiàn)于各種溶血， 尤其血管內(nèi)溶血 2、增高 感染、創(chuàng)傷、惡性腫瘤等,溶血的檢驗(yàn),尿含鐵血黃素檢驗(yàn),原理 當(dāng)血紅蛋白通過(guò)腎濾過(guò)時(shí),部分鐵離子以含鐵血黃素的形式沉積于上皮細(xì)胞,并隨尿排出.上皮細(xì)胞中高鐵離子與亞鐵氰化鉀作用,在酸性環(huán)境下產(chǎn)生藍(lán)色沉淀.參考值 陰性臨床評(píng)價(jià) 慢性血管內(nèi)溶血,溶血的檢驗(yàn),Hp與Rous

19、異同點(diǎn),相同點(diǎn)：都反應(yīng)血管內(nèi)溶血不同點(diǎn)：,紅細(xì)胞膜缺陷的檢驗(yàn),原理 檢測(cè)紅細(xì)胞對(duì)不同濃度低滲鹽溶液的抵抗力.紅細(xì)胞在低滲鹽溶液中,當(dāng)水滲透其內(nèi)部達(dá)一定程度時(shí),紅細(xì)胞發(fā)生膨脹破裂.參考值 開(kāi)始溶血:4.4-4.8G/L 完全溶血:2.8-3.2G/L臨床評(píng)價(jià):脆性增加 球形紅細(xì)胞/橢圓形紅細(xì)胞增多癥;脆性降低 珠蛋白合成障礙等.,,,,,0.32,0.30,0.22,NaCl,,,,,,,,,0.

20、28,0.26,0.24,0.36,0.34,,完全溶血 開(kāi)始溶血 未溶血,,成熟紅細(xì)胞,,淚滴狀紅細(xì)胞,,鐮狀紅細(xì)胞,缺鐵性紅細(xì)胞,,二、自身溶血試驗(yàn)及糾正試驗(yàn) 正常孵育48小時(shí) 0.2-4.0%,加糖 0.1- 0.6%,加ATP 0.1-0.8%。遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥者，ATP、糖均能糾正；G6PD缺乏者，糖糾正；丙酮酸激酶缺乏者，ATP糾正。三、紅細(xì)

21、胞膜三磷酸腺苷活性測(cè)定四、酸化甘油溶血試驗(yàn)五、高滲冷溶血試驗(yàn)六、紅細(xì)胞膜蛋白電泳分析,紅細(xì)胞酶缺陷的檢驗(yàn),原理 在血液中加入亞硝酸鹽使紅細(xì)胞中的亞鐵血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白,正常紅細(xì)胞的G-6-PD催化戊糖旁路使NADP變成NADPH,使高鐵血紅蛋白還原成亞血紅素,通過(guò)比色沒(méi)其濃度.參考值 >75%臨床評(píng)價(jià) G-6-PD酶缺乏患者。中間缺乏者為31-74%。嚴(yán)重缺乏者<30%,（3） 高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)

22、 （methemoglobin reduction test）正常值：定性法（－） 半定量法 還原率>75% G6PD缺陷—定性（＋），半定量<70%。 　 G6PD 高鐵血紅蛋白還原酶G6P NADP 還原型美蘭 HbFe3+6PG

23、 NADPH 氧化型美蘭 HbFe2+ NaNO2,,,,,,,,,,,紅細(xì)胞酶缺陷檢驗(yàn),二、變性珠蛋白小體生成試驗(yàn)三、G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)和活性測(cè)定四、PK熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)和活性測(cè)定五、谷胱甘肽還原酶缺陷檢測(cè),NADP+,NADPH（紫外線下發(fā)熒光）,,G6PD,PEP,,丙酮酸,,乳酸,PK,LDH,,ADP,ATP,,NADH,NAD+,血紅蛋白異常的檢驗(yàn),原理 根

24、據(jù)不同的血紅蛋白帶有不同的電荷,等電點(diǎn)不同,在一定的PH緩沖液中,其所帶電荷不同,在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同,根據(jù)此特點(diǎn)將它們區(qū)分開(kāi).參考值 HBA>95% HBF<2% HBA2為1.0-3.0%臨床評(píng)價(jià) HBA2增多見(jiàn)于ß珠蛋白生成障礙性貧血;HBF見(jiàn)于不穩(wěn)定血紅蛋白增多.,（2）血紅蛋白電泳分析,主要檢查有無(wú)異常Hb區(qū)帶在HbA前出現(xiàn)——快速異常：HbH，J，K組在HbA后出現(xiàn)——慢速異常：HbG，

25、D，E組,,,異常HB帶,+,—,（2） 變性珠蛋白小體生成試驗(yàn),受檢RBC＋乙酰苯肼 作活體染色（甲基紫） 37℃1~2h 有變性珠蛋白小體，則膜上形成紫黑色顆粒結(jié)果：含5個(gè)以上者即（＋） ，正常人<30%意義：不穩(wěn)定Hb也可出現(xiàn)，故僅作篩選,,變性珠蛋白小體,血紅蛋白異常檢驗(yàn),二、聚丙

26、烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)三、抗堿血紅蛋白檢測(cè)四、異丙醇沉淀試驗(yàn)五、熱變性試驗(yàn),第七節(jié) PNH檢驗(yàn),一、酸化血清溶血試驗(yàn)原理：患者體內(nèi)存在對(duì)補(bǔ)體敏感紅細(xì)胞，即紅細(xì)胞在酸性（PH6.4-6.5）的正常血清中孵育，補(bǔ)體被激活，而產(chǎn)生溶血。參考范圍：陰性應(yīng)用評(píng)價(jià)：主要見(jiàn)于PNH患者,（一）酸溶血試驗(yàn)（Ham`s test） 特異性高，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的PNH確診試驗(yàn),PNH檢驗(yàn),二、蔗糖溶血試驗(yàn) 特異性敏感性均不如Ham`s，僅做篩選。

27、三、蛇毒因子溶血試驗(yàn)（復(fù)合蛇毒） 敏感性，靈敏度高于Ham`s，特異性不如Ham`s 。,一、抗人球蛋白試驗(yàn),原理 直接試驗(yàn)應(yīng)用抗人球蛋白試劑與紅細(xì)胞表面的IgG分子結(jié)合,如紅細(xì)胞表面存在自身抗體,出現(xiàn)凝集反應(yīng).參考值 陰性臨床評(píng)價(jià) 自身免疫性貧血,免疫性溶血貧血的檢驗(yàn),第八 免疫性溶血性貧血檢驗(yàn),四、篩選試驗(yàn),(一)抗人球蛋白試驗(yàn)（Coombs` test） 1. 直接抗人球蛋白試驗(yàn)（DAGT） 測(cè)RBC表面結(jié)合的