血細胞計數培訓最終

1、試劑質量檢驗部——王賀,血細胞的分類與計數,血細胞的生成及分化,血液涂片的制備,1、每份樣本制作3張血涂片。要求所用玻片清潔、干燥、無塵，大小為25 mm×75mm，厚度為0.8～1.2mm。并有明確標記。如果樣本中白細胞數量少時，需要制備更多血涂片（如6張）。2、使用EDTA－K2抗凝血液樣本時，應在采集后4小時內制備血涂片。在制片前，樣本應充分混勻。注意，樣本不能冷藏。3、用楔形技術制備血涂片。在玻片近一端1/3處

2、，加一滴（約0.05ml）充分混勻的血液，握住另一張較狹窄的、邊緣光滑的推片，以30º～45º角使血滴沿推片迅速散開，快速、平穩(wěn)地推動推片至玻片的另一端。4、在1小時內，用Romanowsky類型染液染色；或在1小時內，用無水甲醇（含水量﹤3%）固定后染色。,推片技巧,推片傾斜45°±1，推成血膜長度25～35mm，寬度18～20mm，血膜四周留有空隙區(qū)，血膜終尾離玻片終端至少10mm，血膜均

3、勻，薄如蟬翼，尾端形如弧狀，迅速扇（搖）干，血膜具有頭、體、尾不同厚薄區(qū)域。此外，涂片時，還要考慮患者的血液狀態(tài)，如貧血程度、血液粘稠度、WBC或有核細胞多少等因素，調整推片技巧。,血膜至玻片邊緣約5mm,血膜至玻片一端約為總長1/3,血涂片頭部，涂片厚,血涂片體部的檢查區(qū)域,血涂片尾部，涂片太薄,良好血涂片的要求,血膜至少長25mm，至玻片兩側邊緣的距離至少為5mm。血膜邊緣要比玻片邊緣窄，且邊緣光滑，適用于油鏡檢查。血細胞從厚區(qū)

4、到薄區(qū)逐步均勻分布，末端呈方形或羽毛狀。血膜末端無粒狀、劃線或裂隙。所有這些情況會使白細胞集中在這些區(qū)域內。在鏡檢區(qū)域內，白細胞形態(tài)應無人為異常改變。通常，隨著保存時間的延長，抗凝血會造成白細胞形態(tài)的改變，如胞漿內形成空泡，核分解破裂等。應將抗凝血液保存時間的影響減小到最低限度。除部分淋巴細胞增生性疾病外，鏡檢區(qū)域內破損白細胞量應<2％。無人為污染。,瑞氏染色-姬姆薩（ Wright’s-Giemsa’s）混合染色,瑞氏染

5、色的染料配方濃度對細胞核著色程度適中,細胞核結構和色澤清晰艷麗,對核結構的識別較佳,但對胞漿著色偏酸,色澤偏紅,對細胞漿內顆粒特別是嗜天青顆粒及嗜中性顆粒著色較差。 姬姆薩染色對胞漿著色能較好的顯示胞漿的嗜堿性程度,特別對嗜天青、嗜酸性、嗜堿性顆粒著色較清晰, 色澤純正,而對胞核著色偏深,核結構顯示較差。 故采用以瑞氏染液為主，姬姆薩染液為輔的混合染色。,染色步驟,先用瑞氏染液將涂膜面充分覆蓋；稍等片刻再加姬姆薩染液2-3滴加減(

6、根據涂片上細胞多少及增升程度酌情而定)； 稍等1-2分鐘后,再加磷酸鹽緩沖液,加時應緩慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面張力而終止染色液加入； 染色30-40分鐘； 分色：用自來水緩緩沖洗至少3分鐘以上,待干，勿用濾紙吸干,以免濾紙纖維污染涂片。,血涂片檢查的方法和程序,將血液充分混勻，盡早推成血片并染色。先用低倍或高倍鏡觀察。了解血片染色和細胞分布情況、有無血小板或紅細胞聚集（成串、成堆），尾部有無大型、成堆異

7、常細胞等；繼續(xù)用油鏡在涂片厚薄適中處瀏覽血片，仔細觀察紅細胞、白細胞及血小板的形態(tài)，并估計其數量。如果觀察結果與儀器報告相符，不需進行任何補充試驗，即可按儀器測定的結果發(fā)出報告。如為貧血或其他血液病患者，其紅細胞數量及相關的指標（如MCV、MCH、MCHC）紅細胞體積分布寬度（RDW）、直方圖或散點圖出現異常，則著重觀察紅細胞的大小、形態(tài)、內涵物、著色性、大小一致性以及有無有核紅細胞等。如有異常，應加以描述并報告。正常情況下，在血片

8、厚薄適中區(qū)域（每個紅細胞彼此相互接觸但雙不重疊），每個油鏡視野，約有血小板8～15個；或每10～30 個紅細胞見到一個血小板。,血細胞形態(tài)檢查的臨床意義,正常人的血液及造血器官中，各種血細胞的數量有一定的正常范圍，不同血細胞及細胞發(fā)育的不同階段有一定形態(tài)結構特點。 觀察血細胞形態(tài)、數量及其比例的變化是診斷造血系統(tǒng)疾病最基本的檢查方法。 造血系統(tǒng)疾病，引起血細胞形態(tài)學的量和質的改變。血細胞形態(tài)學檢查為臨床提供診斷依據。血細胞形態(tài)學

9、檢查應包括外周血和骨髓兩部分。外周血細胞改變往往反映骨髓病變的重要信息，有利于診斷。,外周血細胞的主要成分,白細胞紅細胞血小板,白細胞計數,WBC計數的正常范圍：4.0~10.0×109/L; WBC正常限度以下: 輕度減少(10.0～20.0×109/L), 中度增多(>20.0～40.0×109/L), 明顯增多(>40.0～80.0×109/L) 極度增多(>

10、80.0×109/L)。,白細胞分類,正常成人白細胞分類范圍：,外周血中常見的五種白細胞,分葉核細胞大小為10～15µm。細胞核與細胞漿比率為1:3。細胞呈圓形或卵圓形。細胞核分葉，葉間有絲狀連接，分為2～5葉。核染色質聚集。無核仁。細胞漿染成淡粉紅色，含大量特異性顆粒。桿狀核細胞大小為10～18µm。細胞核與細胞漿比率為1:1.5～1:2。細胞呈圓形或卵圓形。細胞核呈S形，C形,

11、U形或分葉形，可見峽狀染色質。核染色質粗顆粒狀聚集。無核仁。細胞漿豐富，染成粉紅色；含大量特異性顆粒，罕見嗜天青顆粒。,中性粒細胞,“成熟的粒系白細胞，具有彎曲、帶狀的核形， 核葉間沒有線樣絲（threadlike filament）形成，稱為桿狀核；如果連接核葉之間的橋（bridge）內有染色質，這種橋就不算細絲，也是桿狀核”；“如果細胞核扭曲（twist）、纏繞，造成一部分核壓在另一部分核之上，以至整個核的外形看不清楚，

12、應判為分葉核”,分葉核與桿狀核細胞的區(qū)分,中性粒細胞的毒性變化,所謂中性粒細胞的“毒性”變化，它是指白細胞在細菌、病毒等抗原，在毒素的刺激下，造成的一種形態(tài)學變化。如胞漿內出現“毒性顆粒”、杜爾（Dohle）小體、空泡、脫顆粒以及胞質腫脹等現象；胞核出現固縮（pyknotic）腫脹等。檢查這種變化，首先要制備厚薄適中，染色良好的血片。因為血片太厚，細胞縮小，胞質的內容物不易看清；染色太深，會將正常中性粒細胞漿內的顆粒也染得很深而粗，會誤

13、認為毒性顆粒；胞質內的空泡和杜爾小體等也被掩蓋而不易看清。杜爾小體是一種常在胞漿邊緣部出現的淡藍色小體，實際上是一小塊含RNA 的胞質，故亦稱RNA 包涵體。此類小體在重度細菌感染的血片中甚多見，但往往被檢驗者忽略。在EDTA 抗凝血片中杜爾小體往往染呈灰色而不是淡藍色；如血液儲存過久，杜爾小體甚至會消失。 注意，血液在體外如儲存過久，粒細胞等胞質內也會出現空泡，核也會扭曲、固縮，會誤認為毒性變化。,細胞大小為

14、6～15µm。細胞核與細胞漿比率為5:1～2:1。細胞呈圓形或卵圓形。細胞核通常呈圓形或卵圓形；偶見核凹陷或輕度切跡。核染色質散在致密或粗顆粒狀聚集；副染色質無或少量。無核仁；有時，可見小的、淡的核小體。細胞漿少至中等量；淡藍色至中度嗜堿性；可見核周淡染區(qū)；有時有副核窩；小淋巴細胞無顆粒；大淋巴細胞的細胞漿較多，含少數粗大嗜天青顆粒。異型淋巴細胞細胞大小為10～25µm。細胞核與細胞漿比率為3:1

15、～1:2。細胞形態(tài)各異，呈圓形，卵圓形或不規(guī)則形。細胞核形態(tài)各異，呈圓形，卵圓形，凹陷形，折疊形，裂隙形或分葉形。核染色質可以細致、中度致密或粗顆粒；副染色質無或少量。核仁無或多個；大小和染色性各異。細胞漿中等至大量；染灰色、淡藍色或深藍色；可見細胞邊緣染色深，核周淡染；漿細胞樣淋巴細胞常有核周淡染區(qū)或核窩；有時可見細小嗜天青顆粒；偶見空泡。,淋巴細胞,異型淋巴細胞,外周血中的淋巴細胞，是一類高度異質性的細胞。在病毒、毒素等抗

16、原的刺激下，其中有一部分會發(fā)生增殖并向漿細胞或幼稚細胞（母細胞）轉化，從而導致多種多樣的形態(tài)變化。如細胞體積增大；胞質量變多，藍染加深，有的含有空胞；核呈不規(guī)則的形狀，染色質變得疏松，偶爾隱約可見核仁或絲狀分裂。凡此種種，經常被一些缺乏經驗的檢驗者誤認為是白血病的幼稚細胞。過去由于對這類淋巴細胞的本質了解不夠，曾有很多命名。我國統(tǒng)稱其為異常淋巴細胞，顯然欠妥。因為這類細胞都是正常淋巴細胞對抗原物質的反應，與白血病等出現的惡性（異常）淋巴

17、細胞有根本性區(qū)別。目前國外一般稱之為不典型淋巴細胞（atypicallymphocytes）, NCCLS則建議稱其為變形淋巴細胞（variantlymphocytes）。,細胞大小為12～20µm。細胞核與細胞漿比率為4:1～2:1。細胞呈圓形，可有偽足。細胞核形態(tài)各異，呈圓形、卵圓形、馬蹄形、切跡形或分葉形。核染色質輕度聚集。無核仁。細胞漿含藍灰色顆粒，少量空泡。,單核細胞,成熟型細胞大小為13～15µ

18、;m，幼稚型細胞大小為10～18µm。成熟型細胞核與細胞漿比率為1:3，幼稚型細胞核與細胞漿比率為1:2～2:1。細胞呈圓形或卵圓形。細胞核分葉狀，通常2-3葉，由細絲狀染色質連接。分葉核和桿狀核的核染色質致密、塊狀；幼稚型的核染色質疏松、細致。無核仁。,嗜酸性粒細胞,嗜堿性粒細胞,★細胞大小為10～15µm?！锛毎伺c細胞漿比率為1:2～1:3?！锛毎蕡A形或卵圓形。★細胞核分葉狀，常被顆粒覆蓋。

19、★核染色質聚集?！餆o核仁?！锛毎麧{含粗大、致密、深紫色或黑色顆粒。,臨床意義,,外周血中的紅細胞,正常紅細胞直徑7.2~7.6mm，厚度2mm圓盤狀，兩面凹陷，中央較薄，著色較淺，在涂片中形態(tài)基本一致。正常RBC在體內能經受通過微血管的嚴重變形而不受損害。在高度粘稠血液中的RBC變成橢圓形，紅細胞膜圍繞著所含Hb旋轉，像坦克的踏板（Tread）。脾臟可篩選缺乏彈性的紅細胞、紅細胞異常變形或喪失彈性的紅細胞，并加強對這些紅細胞的

20、清除。 參考值：成年男性（4~5.5）×1012/L；成年女性（3.5~5.0）×1012/L,紅細胞形態(tài)學診斷,RBC/Hb、網織RBC、MCV、MCH、MCHC及RBC體積分布寬度（RDW）是判定貧血類型重要依據：,(1)Hb/RBC比值：正常人：Hb/RBC比值為3gHb/L=100萬RBC/ μL即3:1。AA、溶血性貧血及繼發(fā)性貧血等屬此類。>3:1者即為大細胞高色素性貧血,5%。其網織RBC內嗜

21、堿性網織增多，代償性功能減低者，低于正常水平。多見于AA，但有不典型AA（1/4）患者可有網織RBC增高。網織RBC計數1000個RBC中有多少網織RBC，以其%數表示，是一個比值數，不是絕對值。精確應計算絕對值或用流式細胞儀計數更為確切。 (3)MCV、MCH、MCHC反映RBC病理變化：可將貧血分為大細胞性貧血、正常細胞性貧血、小細胞低色素性貧血及單純小細胞性貧血（即小細胞性正常色素性貧血），其診斷標準及其病因。,影響RBC形態(tài)學

22、人為因素,(1)觀察RBC形態(tài)一般以外周血涂片較為可靠。 (2)RBC形態(tài)與排列（如重疊、緡錢狀）與涂片技術、涂片部位及厚薄有很大關系。這點在鏡檢時應予注意。 (3)即是合格涂片，RBC形態(tài)依然與涂片部位及厚薄等多種因素有關：★如取涂片中心區(qū)域，RBC中心淡染，多 >1/3細胞面積大小;★取自涂片薄處或尾部，RBC形態(tài)誤給人以“球形”，失去雙凹盤形，中心淡染消失，所謂類球形改變； ★取厚片或制片干燥過慢，R

23、BC未攤開，收縮變形，甚至出現人工中心染色過淡等； ★取厚片RBC則重疊堆積，呈假“緡錢狀”，不便查清形態(tài)； ★玻片不清潔，油脂過多或骨髓脂肪過多，制片干燥不快，RBC則會形成人工的中心淡染區(qū)或空白區(qū)。,異常紅細胞,,外周血中的血小板,血小板是無核細胞，形如圓盤狀，直徑只有2～4μm，在血中存活10天左右。鏡下可見血小板多為圓形或橢圓形，亦有少數梭形及不整形者，可有翻轉及布朗運動，一般有1～3個突起，血小板可分為透明區(qū)與顆粒區(qū)，二者

24、沒有明顯分界，顆粒呈深藍色或藍綠色折光，散布于顆粒區(qū)內，可不斷運動，透明區(qū)為淺綠色折光。小型血小板占33％～47％；中型血小板占44.3％～49％；大型血小板占8％～16％；巨型血小板占0.7％～2％。,在顯微鏡下觀察懸浮的微粒，或在無風情形觀察空氣中的煙粒、塵埃時都會看到這種運動。這種運動會隨著溫度的升高而越激烈。 它是1827年植物學家R-布朗首先發(fā)現的。作布朗運動的粒子非常微小，直徑約10

25、-7～10-5米， 在周圍液體或氣體分子的碰撞下，產生一種漲落不定的凈作用力，導致微粒的布朗運動。,什么是布朗運動？,,血小板分布情況,功能正常的血小板在外周血涂片上常可聚集成團或成簇。 原發(fā)性血小板增多癥，血小板集團可以大至占滿整個油鏡視野。 再生障礙性貧血時，血小板集團明顯減少。在血小板無力癥，則不出現聚集成堆的現象。,,細胞的手工計數,血細胞計數板,,,計數池的規(guī)格,計數池共有9個大

26、方格；每個大方格內分為16中方格，每一中方格又分為25小方格。,細胞計數板使用方法,★實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目?！锞唧w操作：1. 將計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板。2. 將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 3. 計算板四大格

27、細胞總數，壓線細胞計數原則（計上不計下，計左不計右）。,細胞懸液充池步驟,紅細胞計數的操作方法,★2ml紅細胞稀釋液中加血10µl，混勻后，充入計數池，靜置3~5min后，在高倍鏡下，計數中央大方格內正中及四角的5個中方格內的紅細胞數。,★紅細胞數/L=N×25/5 ×10 ×106 × 200 =N×1010

28、 =N/100×1012,N：5個中方格內的紅細胞數,★注意： 1.鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液； 2.大方格間的細胞計數結果相差不應超過10%，否則應重新充池。,白細胞計數的操作方法,★白細胞稀釋液0.38ml中加血20µl，充分混勻后充入計數池，靜置2~3min，在低倍鏡下計數四角4個大方格內白細胞