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文檔簡介
1、微生物檢測(cè)的基本操作知識(shí),主要內(nèi)容:,§ 1 清洗、消毒和滅菌§ 2 顯微操作§ 3 制片和染色§ 4 培養(yǎng)基的制備§ 5 接種、分離純化和菌種保存§ 6 微生物常規(guī)鑒定技術(shù),§ 1 清洗、消毒和滅菌,1. 玻璃器皿的清洗 1.1新購的玻璃器皿 浸泡于1~2%的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時(shí),除去游離的堿性物質(zhì)1.2用過的玻璃器皿 污染的器皿,必須經(jīng)過適
2、當(dāng)消毒, 污跡不能洗凈時(shí),可浸泡于洗液內(nèi)。 1.3洗液的配制 稱取重鉻酸鉀100g與1000mL水置大燒瓶中加熱攪拌溶化,待冷卻后,將燒瓶置冷水中,慢慢加入濃流酸250mL,并不斷攪拌。,消毒滅菌的方法,(一)物理消毒滅菌法(二)化學(xué)消毒法,(一)物理消毒滅菌法,1.熱力滅菌法 熱力滅菌法分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。在同一溫度下, 后者效力比前者為大,這是因?yàn)椋?(1)濕熱中細(xì)菌菌體蛋白較易凝固;(2)濕
3、熱的穿透力比干熱大;(3)濕熱的蒸汽有潛熱存在。水由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)釋放出的潛熱,可迅速提高被滅菌物體的溫度。,加熱滅菌和加熱消毒的方法:,干熱滅菌法 火焰滅菌法 干燥加熱空氣滅菌法高溫滅菌 巴氏消毒法
4、 常壓下 煮沸消毒法 濕熱滅菌法 間歇滅菌法 常規(guī)加壓滅菌法 加壓下
5、 (高壓蒸汽滅菌法) 連續(xù)加壓滅菌法,,,,,,干熱滅菌法,1.焚燒:是一種徹底的滅菌方法,但僅適用于廢棄物品或尸體等。2.燒灼:直接用火焰滅菌,適用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的接種環(huán)、試管口等的滅菌(圖3-2)。3.干烤:用烤箱滅菌。一般加熱至160℃~170℃經(jīng)2小時(shí)。適用于高溫下不變質(zhì)、不蒸發(fā)的物品, 如玻璃器
6、皿、瓷器等。。,濕熱滅菌法,1.煮沸法:1個(gè)大氣壓下,煮沸的水溫為100℃,一般細(xì)菌繁殖體煮沸5分鐘即被殺死。細(xì)菌芽胞常 需煮沸1~2小時(shí),才被殺死。水中加入 2%碳酸鈉,既可提高沸點(diǎn)達(dá)105℃,促進(jìn)細(xì)菌芽胞的殺滅,又 可防止金屬器皿生銹。 2.巴氏消毒法(pasteurization):用較低溫度殺滅液體中的病原菌、同時(shí)又不影響消毒物品的營 養(yǎng)成分及香味的消毒方法。加熱61.1~62.8℃半小時(shí)即可,常用于牛奶和酒類等的消毒。,3.
7、 間歇滅菌法(fractional sterilization):將待滅菌的物品100℃ 加熱15~30分 鐘,殺死其中的細(xì)菌繁殖體,然后將物品置于37℃溫箱中過夜使芽胞發(fā)育成繁殖體,次日再通過流通蒸 汽加熱,如此連續(xù)三次,可將所有細(xì)菌繁殖體和芽胞全部殺死。 4.高壓蒸汽滅菌法:是滅菌效果最好、目前應(yīng)用最廣的滅菌方法。方法是在一密閉蒸鍋—高壓蒸汽 滅菌器內(nèi)進(jìn)行的。通常 在1.05kg/cm2的壓力下,溫度達(dá)121.3℃,維持15~30
8、分鐘,可殺死包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。 此法適用于耐高溫和不怕潮濕物品的滅菌。,2.紫外線與射線滅菌法,1.紫外線:紫外線波長為240~280nm時(shí)具有殺菌作用,其中 以260nm最強(qiáng)。紫外線殺菌機(jī)理主要是作用于細(xì)菌DNA,使同一條DNA 鏈上相鄰的兩個(gè)胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)合而形成嘧啶二聚體,因而改變DNA的分子構(gòu)型,干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制與 轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致細(xì)菌的死亡或變異。紫外線穿透力差,故只適用于空氣及不耐熱物品的表面消毒。 2.電離輻射
9、:高速電子、X 射線和γ射線等在足夠劑量時(shí),對(duì)各種細(xì)菌均有致死作用。其機(jī)制在于 產(chǎn)生游離基,破壞細(xì)菌DNA。電離輻射常用于大量一次性醫(yī)用塑料制品的消毒。,3.濾過除菌,濾過除菌是用物理阻留的方法將液體或空氣中的細(xì)菌除去,以達(dá)到無菌的目的。所用的器具是濾菌器(filter)?! V過除菌主要用于一些不耐高溫滅菌的血清、細(xì)菌毒素、抗生素,以及空氣等的除菌?! V菌器的種類很多,目前常用的有濾膜濾菌器、石棉濾菌器(亦稱Seitz濾菌
10、器)、玻璃濾菌器等。,(二)化學(xué)消毒法,用化學(xué)藥品進(jìn)行消毒的方法,由于化學(xué)藥品對(duì)細(xì)菌及人體都有毒性,故只能用于體表、醫(yī)療器械及周圍環(huán)境等的消毒。 殺菌機(jī)制:(1)使菌體蛋白質(zhì)變性或凝固;(2)干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)和代謝;(3)影響細(xì)菌胞漿膜的通透性。,影響消毒滅菌效果的因素,1.消毒劑的性質(zhì)、濃度和作用時(shí)間:一般情況下濃度越大,作用時(shí)間越長,殺菌效果越好。但95%的 乙醇消毒效果反不如75%為好,因?yàn)楦邼舛纫掖际辜?xì)菌表面的蛋白質(zhì)迅速
11、脫水而凝固,影響乙醇進(jìn)入菌體內(nèi),減弱其殺菌作用。 2.微生物的種類與數(shù)量:同種消毒劑對(duì)不同微生物的殺菌效果不同。如結(jié)核桿菌對(duì)酸、堿的抵抗力 比其他的菌強(qiáng);70%乙醇可殺死一般細(xì)菌繁殖體,但不能殺滅細(xì)菌芽胞。因此,必須根據(jù)消毒對(duì)象選擇合適的消毒劑。3.環(huán)境中有機(jī)物的影響:消毒環(huán)境中如有有機(jī)物存在,如血清、膿汁、痰、糞便等,可與消毒劑結(jié)合而影響殺菌效果。,§ 2 顯微操作,顯微鏡是微生物檢驗(yàn)中最常用的精密光學(xué)儀器。顯微鏡的種
12、類很多,在實(shí)驗(yàn)室中常用的有:普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。食品微生物檢驗(yàn)中最常用的是普通光學(xué)顯微鏡。,,普通顯微鏡的使用方法,1低倍鏡觀察 2高倍鏡觀察 3油浸鏡觀察 使用油浸鏡時(shí),鏡臺(tái)要保持水平,防止油流動(dòng),油浸鏡所用的油要潔凈。,普通顯微鏡的保養(yǎng),(1)觀察完后,移去觀察的載玻片標(biāo)本。(2)用過油浸鏡的,應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去,再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次,最后再用擦鏡紙
13、將二甲苯擦去。(3)轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器,放在低倍鏡的位置。(4)將鏡身下降到最低位置,調(diào)節(jié)好鏡臺(tái)上標(biāo)本移動(dòng)器的位置,罩上防塵套。鏡頭清潔,只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙 ,物鏡的清洗,可選用不同的溶劑,如酒精、丙酮和二甲苯等,其中最安全的是二甲苯。,染色方法,(一)簡單染色法 簡單染色法又叫作普通染色法,只用一種染料使細(xì)菌染上顏色,觀察細(xì)菌的形態(tài)。,(二)復(fù)染色法 用兩種或多種染料染細(xì)菌,目的是為了
14、鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌,所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。 革蘭氏染色法:不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài),而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類: 染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌,用G+表示; 染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌,用G-表示?!〖?xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng),是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。,實(shí)驗(yàn)材料,1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈等。
15、2.石炭酸復(fù)紅染液、草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95%乙醇、蕃紅染液3.菌種,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟,(一)細(xì)菌的簡單染色步驟 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢1.涂片 取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水,將接種環(huán)在火焰上燒紅,待冷卻后從斜面挑取少量培養(yǎng)物與玻片上的水滴混勻后,在載玻片上涂布成一均勻的薄層,涂布面不宜過大。2.干燥 涂片最好在室溫下使其自然干燥,有時(shí)為了
16、使之干得更快些,可將標(biāo)本面向上,手持載玻片一端的兩側(cè),小心地在酒精燈上高處微微加熱,使水分蒸發(fā),但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長,以防標(biāo)本烤枯而變形。,3.固定 手持載玻片的一端,標(biāo)本向上,在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次,共約2~3秒鐘,并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚,不覺過燙為宜(不超過60℃),放置待冷后,進(jìn)行染色。4.染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一種)一滴,使
17、染色液覆蓋涂片,染色約1min。5.水洗 斜置載玻片,在自來水龍頭下用小股水流沖洗,直至洗下的水呈無色為止。6.干燥 用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠,置于室溫下自然干燥。用吸水紙時(shí)切勿將菌體擦掉。,7.鏡檢(二)細(xì)菌的革蘭氏染色步驟 涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復(fù)染→水洗→干燥→觀察1.取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定,方法均與簡單染色的相同。
18、2.用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。3.加碘液媒染1min后水洗。4.斜置載玻片,滴加95%乙醇脫色,至流出的乙醇不現(xiàn)紫色 為止,大約需時(shí)20~30s,隨即水洗。,5.用蕃紅染液復(fù)染1min,水洗。6.用吸水紙吸掉水滴,待標(biāo)本片干后置顯微鏡下,用低倍鏡觀察,發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察,注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。,革蘭氏染色圖解,,革蘭氏染色試劑,,步驟1:用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上,,步驟2:用無菌操作法取少許培
19、養(yǎng)物于蒸餾水滴上,,步驟3:用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層,,步驟4:風(fēng)干,,步驟5:在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次固定,,步驟6:結(jié)晶紫染色1分鐘,,步驟7:用蒸餾輕輕沖洗玻片,,步驟8:革蘭氏碘液染色1分鐘,再用蒸餾水輕輕沖洗,,步驟9:酒精脫色至下滴液為無色,立即用蒸餾水沖洗,,步驟10:番紅復(fù)染1分鐘,用蒸餾水輕輕沖洗,,大腸桿菌(Escherichia coli)革蘭氏染色圖,革蘭氏染色陰性桿菌(紅色),,金黃色葡萄球菌
20、(Staphylococcus aureus)革蘭氏染色,革蘭氏染色陽性球菌(紫色),注意事項(xiàng),1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間,如脫色過度,革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌;如脫色時(shí)間過短,革蘭氏陰性菌也會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。因此必須 嚴(yán)格把握脫色時(shí)間。2 .選用培養(yǎng)18-24小時(shí)菌齡的細(xì)菌為宜,若細(xì)菌太老,由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。,4.培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng),4.1培養(yǎng)基配方的選定
21、 同一種培養(yǎng)基的配方在不同資料中常會(huì)有某些差別。因此,除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法,應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外,一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料,加以比較核對(duì),再依據(jù)自己的使用目的,加以選用,記錄其來源。,4.2培養(yǎng)基的制備記錄,每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄,包括培養(yǎng)基名稱,配方及其來源,和各種成份的牌號(hào),最終pH值、消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等,記錄應(yīng)復(fù)制一份,原記錄保存?zhèn)洳?,?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。,4.3培養(yǎng)基成分的稱取
22、,培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂,最好一次完成,不要中斷。可將配方置于傍側(cè),每稱完一種成分即在配方上做出記號(hào),并將所需稱取的藥品一次取齊,置于左側(cè),每種稱取完畢后,即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后,還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。,4.4培養(yǎng)基各成份的混合和溶化,使用不銹鋼鍋或大燒杯等加熱溶化,不能用銅鍋或鐵鍋,以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中,使細(xì)菌不易生長。在鍋中溶化時(shí)、可先用溫水加熱并隨時(shí)攪動(dòng)、以防焦化,如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使
23、用,應(yīng)重新制備。待大部分固體成分溶化后,再用較小火力使所有成分完全溶化,直至煮沸。如為瓊脂溶化,用另一部分水溶化其它成分,然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中,因蒸發(fā)而丟失的水分,最后必須加以補(bǔ)足。,4.5培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正,因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會(huì)有所變化,培養(yǎng)基各成分完全溶解后,應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如,牛肉浸液約可降低pH0.2,而腸浸液pH卻會(huì)有顯著的升高。因此,對(duì)這個(gè)步驟,操作者應(yīng)隨時(shí)注意探索經(jīng)驗(yàn)、以期能掌握培養(yǎng)
24、基的最終PH,保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。PH調(diào)整后,還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘,以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。,4.6培養(yǎng)基的過濾澄清,液體培養(yǎng)基必須絕對(duì)澄清,瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀,必要時(shí),采用過濾或其它澄清方法。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法,濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形,以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂?! …傊囵B(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去,再用
25、濾紙反復(fù)過濾。,4.7培養(yǎng)基的分裝,培養(yǎng)基的分裝分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵,制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁,不留縫隙,以防外界微生物沿縫隙侵入,棉塞不宜過緊或過松,塞好后以手提棉塞,試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2/3在試管內(nèi),1/3在試管外。其外還須用防水紙包扎。(目前試管一般多有用螺旋蓋,采用金屬或塑料試管帽)。,分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時(shí),分
26、裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)?! 》盅b容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒,以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中,隨該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌,作為測(cè)定該批培養(yǎng)基最終pH之用。,4.8培養(yǎng)基的滅菌,一般培養(yǎng)基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中,如無特殊規(guī)定,即可用此法滅菌。某些畏熱成分,如糖類,應(yīng)另行配成20%或更高的濃液,以過濾或間歇滅菌法消毒,以后
27、再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50°C左右的培養(yǎng)基中。,4.9培養(yǎng)基斜面和平板的制作,瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出,冷至55℃-60℃時(shí),擺置成適當(dāng)斜面,待其自然凝固。斜面長度不超過試管長度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時(shí),滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝。制作平板培養(yǎng)基時(shí),將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后,待冷至5
28、0℃左右傾入無菌培養(yǎng)皿中,溫度過高時(shí),皿蓋上的冷凝水太多;溫度低于50℃,培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。,平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行,右手拿錐形瓶的底部或試管,左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開,灼燒瓶口,用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫,至瓶口正好伸入,傾入10~12mL的培養(yǎng)基,迅速蓋好皿蓋,置于桌上,輕輕旋轉(zhuǎn)平皿,使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中,冷凝后即成平板。,4.10培養(yǎng)基的質(zhì)量測(cè)試,每批培養(yǎng)基制備好以后,應(yīng)仔細(xì)檢查一遍,如發(fā)現(xiàn)破裂、水分
29、浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測(cè)定其最終pH。將全部培養(yǎng)基放入36±1°C恒溫箱培養(yǎng)過夜,如發(fā)現(xiàn)有菌生長,即棄去。用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種1~2管或瓶培養(yǎng)基,培養(yǎng)24~48小時(shí),如無菌生長或生長不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次,如結(jié)果仍同前,則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去,不能使用。,4.11培養(yǎng)基的保存,培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處,最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時(shí)間不宜超過一周,傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培
30、養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標(biāo)簽。,§5接種、分離純化培養(yǎng)和菌種保存,5.1接種 將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。,5.1.1接種工具和方法,,1.接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀,圖5-1 接種和分離工具,常用的接種方法有以下幾種:,(1)劃線接種 最常用,工具:接種環(huán),接種針,在斜面接種和平板劃線中就常用此法。
31、 (2)三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法?! ?3)穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí),用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是:用接種針蘸取少量的菌種,沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺,如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng),則在穿刺線周圍能夠生長。,(4)澆混接種(5)涂布接種(6)液體接種 固體培養(yǎng)基→液體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)物→液體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)物→固體培養(yǎng)基。(7)注射接種
32、 疫苗預(yù)防接種,就是用注射接種,接入人體,來預(yù)防某些疾病。(8)活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法,接種的方式是注射,也可以是拌料喂養(yǎng)。,5.1.2無菌操作,培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后,用經(jīng)過滅菌的工具(如接種針和吸管等)在無菌條件下接種含菌材料(如樣品、菌苔或菌懸液等)于培養(yǎng)基上,這個(gè)過程叫做無菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。,接種時(shí),打開培養(yǎng)皿的時(shí)間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰
33、等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法:通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅(接種柄,一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊慢慢地來回通過火焰三次),冷卻,先接觸一下培養(yǎng)基,待接種環(huán)冷卻到室溫后,方可用它來挑取含菌材料或菌體,迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。(圖5-2)然后,將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌,復(fù)原。不要直接燒環(huán),以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時(shí),通常把平板的面傾斜,把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進(jìn)行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí),試管口或瓶壁外面不要
34、接觸底皿邊,試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。,,圖5-2 斜面接種時(shí)的無菌操作,(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞,5.2分離純化,含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物(Mixed culture)。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來自于一個(gè)親代細(xì)胞,那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)(Pure culture)。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí),所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純
35、化。,5.2.1傾注平板法,首先把微生物懸液通過一系列稀釋,取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合,然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中,待凝固之后,把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落,取單個(gè)菌落制成懸液,重復(fù)上述步驟數(shù)次,便可得到純培養(yǎng)物。,,圖1 傾注平板法(a)涂布平板法(b)圖解,1.菌懸液 2.熔化的培養(yǎng)基 3.培養(yǎng)物 4.無菌水,,,5.2.2涂布平板法,首
36、先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂?,取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上,然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上,經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。(圖1 b),5.2.3平板劃線法,最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多,常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。(圖2)當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí),接種環(huán)上的菌液逐漸
37、稀釋,最后在所劃的線上分散生長,各自形成菌落,以便根據(jù)菌落形態(tài)及特征,挑選單個(gè)菌落,經(jīng)過移種而獲得純種細(xì)菌 (純培養(yǎng))。,,圖2 平板劃線分離法,1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,,,,,5.2.4富集培養(yǎng)法,富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長,使其能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng),在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物?! ∷鶆?chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫
38、受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下,經(jīng)過多次重復(fù)移種,最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。,5.2.5厭氧法,為了分離某些厭氧菌,利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器,把這支試管放在沸水浴中加熱數(shù)分鐘,以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻,并進(jìn)行接種。接種后,加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面,使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是,在接種后,利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體,然后在火焰上把試管口密封。把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上,然
39、后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。,5.3培養(yǎng),微生物的生長,除了受本身的遺傳特性決定外,還受到許多外界因素的影響,如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、PH等。微生物的種類不同,培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。,5.3.1影響微生物生長的因素,一)營養(yǎng)物濃度 二)溫度 根據(jù)微生物最適生長溫度的不同,可將它們分為三個(gè)類型: (1)嗜冷微生物:其是適生長溫度多數(shù)在-10℃-20℃之間 (2)中溫微生物:其最適生長溫度一般在20℃
40、-45℃之間 (3)嗜熱微生物:生長溫度在45℃以上。,三)水分 四)氧氣 (1)需氧微生物 (2)兼性需氧微生物 (3)微量需氧微生物 (4)耐氧微生物 (5)厭氧微生物,5.3.2培養(yǎng)方法,根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣,可分為:好氧培養(yǎng);厭氧培養(yǎng)。,一)好氧菌的培養(yǎng),(1)固體表面培養(yǎng)法 (2)液體培養(yǎng)法,二)厭氧菌的培養(yǎng),(1)深層穿刺培養(yǎng)(2)化學(xué)吸氧與深層穿刺相結(jié)合 (3)抽氣法,5.4菌種保存,菌種保
41、藏方法很多,但主要是根據(jù)以下原則而設(shè)計(jì)的:(1)必須選用典型優(yōu)良純培養(yǎng)物進(jìn)行保藏,并盡量采用其休眠體,如細(xì)菌物芽孢,真菌的孢子等進(jìn)行保藏;(2)創(chuàng)造有利于微生物休眠的環(huán)境條件,如低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)以及添加保護(hù)劑等;(3)盡量減少傳代次數(shù)。采用以上措施有利于達(dá)到長期保藏的目的。,(1)低溫保存,4~5℃左右的凍箱中貯存。一般細(xì)菌可保存1~3個(gè)月、酵母菌和霉菌可保存2~6個(gè)月后,再移種到新配的斜面培養(yǎng)基1次,經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后,再行
42、保藏。 優(yōu)點(diǎn)是操作簡單,不需特殊設(shè)備; 缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短,菌種經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)接后,遺傳性狀易發(fā)生變異,生理活性減退。,斜面保藏法 將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上, 待其充分生長后,用牛皮紙將棉塞部分包扎 好(棉塞換成膠塞效果更好),置4C?冰箱中 包藏。 保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、 放線菌及芽孢菌保存2-4個(gè)月移種一次,酵 母菌間隔兩個(gè)月,普通細(xì)菌一個(gè)月,假單胞 菌兩周傳代一次。 此法
43、優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、使用方便,缺點(diǎn) 是保藏時(shí)間短、易被污染。穿刺保藏法 按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種,菌種長好后用 膠塞封嚴(yán),置4℃冰箱存放。,礦物油保存,菌種在瓊脂斜面上或在半固體瓊脂試管中生長后,在試管中再加入無菌液體石蠟,覆蓋在培養(yǎng)基上面,這樣就會(huì)使菌種和培養(yǎng)基與外界空氣隔離,并可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā),管口可用固體石蠟封口,放置低溫保存,至少保存6個(gè)月至1年。此法適于保藏霉菌、酵母菌和放線菌。但有些細(xì)菌和霉菌如固氮菌
44、、乳桿菌、分枝桿菌和毛霉、根霉等不宜用此法保存。,§6微生物常規(guī)鑒定技術(shù),6.1形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察 6.1.1微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色,在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進(jìn)行觀察,直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性,根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。,6.1.2微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。 (1)
45、細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容:在固體培養(yǎng)基上,觀察菌落大小、形態(tài)、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況(菌膜、環(huán))混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。(圖6-1),(2)霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征:大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體,在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似,只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似,有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的
46、絲狀體,菌絲粗長,在條件適宜的培養(yǎng)基里,菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色,因而菌落邊緣和中心,正面和背面顏色常常不同,如青霉菌:孢子青綠色,氣生菌絲無色,基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。,6.2生理生化試驗(yàn),6.2.1適應(yīng)環(huán)境特性試驗(yàn)6.2.1.1生長溫度的試驗(yàn)微生物在一定的溫度范圍內(nèi)能進(jìn)行其生命活動(dòng)。如超出適宜溫度的范圍,便會(huì)產(chǎn)生不利影響,各種不同的微
47、生物所需的最適溫度各不相同。因此,一定要掌握好微生物的最適溫度。一般病原菌的最適溫度是37℃,但在10~45℃范圍內(nèi)均可生長。,6.2.1.2生長pH試驗(yàn)pH對(duì)微生物發(fā)育影響很大。有的細(xì)菌能耐酸如乳酸桿菌等;有的細(xì)菌能耐堿,如霍亂弧菌在pH9.2能生長。但大多數(shù)微生物的最適pH為7.2~7.6,pH過低或過高,則生長不良或不生長。,6.2.1.3耐鹽性試驗(yàn)這是一項(xiàng)觀察滲透壓對(duì)微生物生長影響的試驗(yàn)。不同的微生物對(duì)鹽的濃度要求不一?;【?/p>
48、屬的細(xì)菌除霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌可在無鹽蛋白胨水中生長外,其他弧菌均需要有鹽才能生長。如副溶血弧菌在無鹽培養(yǎng)基中不能生長,含鹽35g/L時(shí)生長最好。因此,可以利用含鹽和不含鹽的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒別。不同濃度的氯化鈉生長試驗(yàn),可利用含有不同濃度的氯化鈉肉湯管,例如:無鹽,0.5%,4%,6%,7%,8%,9%,10%。將待檢菌種接種后置36℃培養(yǎng),觀察生長情況,判定生長的氯化鈉濃度。,6.2.1.4耐熱試驗(yàn)?zāi)蜔嵩囼?yàn)是測(cè)定微生物對(duì)溫度的抵抗力
49、。不同的微生物對(duì)熱的抵抗力不同。一般細(xì)菌的繁殖體于60~70℃熱水中30min內(nèi)死亡,在100℃沸水中立即死亡。細(xì)菌芽孢對(duì)熱抵抗力強(qiáng),炭疽芽孢在100℃沸水中存活12min。肉毒桿菌芽孢需6h才能死亡。試驗(yàn)方法:取18~24h肉湯培養(yǎng)物各0.1mL,接種于一系列肉湯管內(nèi),分別放在50℃,53℃,56℃,60℃,65℃,70℃,90℃水浴中,隔水加熱10min或30min,取出時(shí)立即浸入冷水中冷卻,然后放37℃培養(yǎng),判定致死的最低溫度和
50、時(shí)間。,6.2.2生化反應(yīng)微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物,生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。,一)糖酵解試驗(yàn),,圖中②③⑤為產(chǎn)酸管,圖中③⑤管)為產(chǎn)氣陽性,細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力,從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別,二)淀粉水解試驗(yàn),,某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶,把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再變藍(lán)色。,,三)V-P試驗(yàn),,,
51、某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強(qiáng)堿環(huán)境下,被空氣中氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱V-P(+)反應(yīng),一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別,四)甲基紅(Methyl Red)試驗(yàn),,五)靛基質(zhì)(Imdole)試驗(yàn),,,,六)硝酸鹽(Nitrate)還原試驗(yàn),,七)明膠(Gelatin)液化試驗(yàn),大腸桿菌:陰性(明膠為固態(tài)) 假單胞菌:陽性(明膠被液化),
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