實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因生物的gus檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)八、轉(zhuǎn)基因生物的GUS檢測(cè),實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)GUS(β- 葡萄糖苷酸酶)活性測(cè)定，了解報(bào)告基因在基因工程中的應(yīng)用。,技術(shù)應(yīng)用：1. Gus基因與目的基因連接構(gòu)建融合基因進(jìn)行組織定位； 2. gus基因與啟動(dòng)子連接來(lái)研究啟動(dòng)子的表達(dá)的組織特異性。,要求：了解通過(guò)顯色反應(yīng)檢驗(yàn)外源基因的表達(dá)情況的方法，了解報(bào)告基因的概念。,材料： 轉(zhuǎn)化的植物組織、器官、原生質(zhì)體、 種子的胚及萌發(fā)的幼苗等。 非轉(zhuǎn)化的相同材

2、料（陰性對(duì)照）。,試劑： 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc） ；N-N-二甲基甲酰胺(DMF) ； NaH2PO4； Na2HPO4 ； Na2EDTA ；Triton-100； K3 [Fe(CN) 6] （鐵氰化鉀）；K4 [Fe(CN) 6] （亞鐵氰化鉀）,原理,適宜的反應(yīng)條件下，β- 葡萄糖苷酸酶（GUS）可將X－Gluc水解成藍(lán)色物質(zhì)，因此具有GUS活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)色斑點(diǎn)，可用肉眼或顯微鏡

3、觀察到。,相關(guān)知識(shí)鏈接——標(biāo)記基因,標(biāo)記基因是幫助對(duì)轉(zhuǎn)基因生物體進(jìn)行篩選和鑒定的一類外源基因，包括選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因。常用的選擇標(biāo)記基因包括有抗生素抗性基因和除草劑抗性基因（Bar 基因）。標(biāo)記基因通常與目的基因構(gòu)建在同一表達(dá)載體上，一起轉(zhuǎn)入生物，但有時(shí)，標(biāo)記基因本身就是目的基因，如除草劑抗性基因。,報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌

4、合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。報(bào)告基因是研究基因調(diào)控的有力工具，常用于判斷試驗(yàn)基因的轉(zhuǎn)化效率以及基因的調(diào)控與功能的研究實(shí)驗(yàn)中。,報(bào)告基因必須具備的條件,(1)已被克隆和全序列已測(cè)定; (2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中不存在，即無(wú)背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無(wú)相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物; (3) 報(bào)告基因編碼的產(chǎn)物的檢測(cè)應(yīng)該快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好，表達(dá)

5、產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定。(4) 細(xì)胞內(nèi)其它的基因產(chǎn)物不會(huì)干擾報(bào)告基因產(chǎn)物的 檢測(cè)。,常見的報(bào)告基因：,在植物基因工程研究領(lǐng)域，已使用的報(bào)告基因有以下幾種： 常用的報(bào)告基因包括β—葡萄糖苷酸酶報(bào)告基因(gus), 胭脂堿合成酶基因(nos)、章魚堿合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTll)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶(β-gal，β-galactosidase)、螢光素酶(luc，luci

6、ferase)、和綠色熒光蛋白基因(gfp，green fluorescence protein)等.,利用報(bào)告基因表達(dá)載體的研究技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：,其一，避開內(nèi)源和外源基因表達(dá)水平的影響：對(duì)于報(bào)告基因編碼產(chǎn)物的檢測(cè)水平可以精確地反映基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，不會(huì)受到內(nèi)源性基因表達(dá)產(chǎn)物水平的影響.第二，易于檢測(cè)：如果研究不同基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，采取本身基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)方法，必須建立各種基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)方法，有些基因的表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)技術(shù)還不

7、具備，或者很難建立，而采用報(bào)告基因的研究策略就很容易解決這一問(wèn)題，只要建立穩(wěn)定的報(bào)告基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)就可以用于不同基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)和研究。,gus基因簡(jiǎn)介,gus基因是目前常用的一種報(bào)告基因，是β－D－ 葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表達(dá)產(chǎn)物β-葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸 ，它可以將5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解為藍(lán)色的物質(zhì),也可以將4-甲基-傘形花酮-β-D-葡萄

8、糖苷酯(4-MUG)分解為藍(lán)色物質(zhì)。 其檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、穩(wěn)定，且背景活性低。gus基因的最大優(yōu)點(diǎn)是它能測(cè)定外源基因表達(dá)的具體細(xì)胞和組織部位，這是其它報(bào)告基因所不能及的。,藥品配方,1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺(DMF)配成20mM的貯存液，分裝成每管100µL，保存于-20℃。2）X－Gluc基液（50mM PBS， pH7.0）。配制方法：50mM NaH2PO4·0.

9、78g/100ml；50mM Na2HPO4 1.79g/100ml共同溶解； Na2EDTA （10mM，372mg），Triton-100（0.1％，100μl）, K3 [Fe(CN) 6] （鐵氰化鉀）（0.5mM，16.5mg）K4 [Fe(CN) 6] （亞鐵氰化鉀）（0.5mM，21.1mg）染色液：50μl X-Gluc母液＋450μl基液,染色方法,將準(zhǔn)備好的試材浸泡在染液，于25—37℃保溫1小時(shí)至過(guò)夜。葉片等綠