戴春華。凋亡抑制因子在肺癌放射耐受機(jī)理中的作用

1、,凋亡抑制基因在肺癌放射耐受機(jī)理中的作用及臨床應(yīng)用研究 戴春華,今天著重討論下面一些問題,腫瘤治療的困惑個(gè)體化治療的要求目前熱門的研究假設(shè)與設(shè)想前期的研究與進(jìn)展我們的一些研究工作研究目標(biāo)和預(yù)期研究成果,,一、腫瘤治療的困惑,肺癌是全球發(fā)病率和死亡率增加最快的腫瘤，在中國(guó)肺癌發(fā)病率和病死率，居惡性腫瘤的首

2、位，并仍在快速直線攀升 。 但在肺癌發(fā)病率不斷增長(zhǎng)的同時(shí)，由于缺乏有效的早期診斷方法和治療措施，因此預(yù)后不良，中位生存期約為6個(gè)月，2年生存率僅為10％，肺癌總的治愈率仍低于15%。,,二、個(gè)體化治療的要求,,無(wú)論手術(shù)，還是放化療等非手術(shù)治療，其總的五年生存率大約在10-20%左右,并且這個(gè)水平已達(dá)到了一個(gè)平臺(tái)。在臨床確診時(shí)，大多系中晚期患者，60-70%需要放化療，但是由于缺乏個(gè)體化的治療方案，總的療效較差。放射治療仍是中晚期非小

3、細(xì)胞肺癌的主要治療手段之一，但是有些患者療效較好，有些患者卻較差。因此通過基因、蛋白等分子生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)篩選最能夠從放化療中獲益的個(gè)體或人群，對(duì)于實(shí)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化治療、提高個(gè)體療效至關(guān)重要。,三、目前放療界最熱門的研究,如何提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性同時(shí)減少放射耐受（1）促凋亡基因（2）凋亡抑制基因,,研究顯示凋亡反應(yīng)的提高提示細(xì)胞有更大的放射敏感性，增加凋亡反應(yīng)的同時(shí)伴隨著細(xì)胞敏感性的增加現(xiàn)在有學(xué)者將誘導(dǎo)凋亡水平作為腫瘤放

4、射敏感性衡量指標(biāo)。Lang FF,Yung WK,Raju U,et al.Enhancement radiosensitivity of wild-type p53 humanglioma cells by adenovirus-mediated delivery of the p53 gene.J Neurosurg, 1998, 89(1): 125-132.Kurdoglu B,Cheong N,Guan J,Corn

5、 BW, et al. Apoptosis as a predictor of Paclitaxel-induced radiosen sitization in human tumor cell lines.Clin Cancer Res, 1999, 5(9): 2580-2587.,,目前促凋亡基因的研究很多。但是對(duì)凋亡抑制基因在腫瘤放射耐受機(jī)理中的作用研究還非常少，尤其是目前最新發(fā)現(xiàn)的survivin，livin就更加不知

6、道他們?cè)诜派淠褪軝C(jī)理中的角色,,四、假設(shè)與設(shè)想：,提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性同時(shí)減少放射耐受可能的方法與途徑,,（1）首先能夠闡明凋亡抑制基因在腫瘤細(xì)胞固有的和放射誘導(dǎo)的放射耐受機(jī)制的作用（2）其次針對(duì)凋亡抑制基因這個(gè)靶點(diǎn)，干擾其活性,,致力于探索誘發(fā)細(xì)胞凋亡的方法，以期提高細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性可能成為一種極具廣泛治療前景的新方法。研究發(fā)現(xiàn)許多人體基因均參與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控。其中誘導(dǎo)凋亡的基因有wtp53, c-myc, El

7、A, Apo-1/Fas, ced-3, ced-4等，而抑制凋亡的有bcl-2, mtp53, H-ras, ced-9和ElB等。其中尤以bcl-2及p53最引人注目，而bcl-2已被證明與細(xì)胞放射敏感性密切相關(guān):其表達(dá)下調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)射線的敏感性增加。,,調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,作為腫瘤放療的增敏,根據(jù)細(xì)胞凋亡可調(diào)控的特點(diǎn),利用生物治療辦法調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,可以作為腫瘤放療的增敏劑,降低腫瘤細(xì)胞的放射誘導(dǎo)凋亡的閾值,克服腫瘤細(xì)胞

8、對(duì)放療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗性并增強(qiáng)腫瘤放療效果已成為科研工作者的一個(gè)努力的方向。,五、前期的工作與進(jìn)展,,越來(lái)越多的研究表明，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖一樣，同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及臨床治療有密切的關(guān)系。放射治療作為腫瘤治療的重要手段之一, 其作用方式主要是通過損傷細(xì)胞的DNA , 影響細(xì)胞的增殖狀態(tài), 改變細(xì)胞周期的運(yùn)行, 最終引起腫瘤細(xì)胞的增殖性死亡或凋亡。凋亡抑制基因可能正是在這些方面發(fā)揮作用從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的放療抵抗。,,survivin

9、 livin是凋亡抑制蛋白家族最近發(fā)現(xiàn)的新成員，他們?cè)诜伟┙M織中的表達(dá)以及與肺癌細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系報(bào)道甚少，他們?cè)诩?xì)胞固有的和放射誘導(dǎo)的放射耐受機(jī)制的作用沒有研究,尤其是livin還沒有這方面的報(bào)道。,,,Ling X等通過檢測(cè)24例NSCLC中survivin的兩個(gè)間接變構(gòu)體survivin-2B 和survivin-△Ex3在的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)survivin-2B高水平的表達(dá)與患者無(wú)復(fù)發(fā)和存活有關(guān)，相反survivin-△Ex3高水平

10、的表達(dá)與患者復(fù)發(fā)和死亡有關(guān)。與此一致，肺癌細(xì)胞株A549中survivin-2B能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，survivin-△Ex3則保護(hù)線粒體電位，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。從而認(rèn)為survivin-2B 和survivin-△Ex3在NSCLC中有著相反的作用，為肺癌的治療提供了新的方向。Differential expression of survivin-2B and survivin-DeltaEx3 is inversely as

11、sociated with disease relapse and patient survival in non-small-cell lung cancer (NSCLC). Lung Cancer. 2005 Sep;49(3):353-61,,Survivin 與腫瘤放療抵抗的關(guān)系Survivin參與細(xì)胞固有的和放射誘導(dǎo)的放射耐受機(jī)制，抑制Survivin的mRNA表達(dá)可能會(huì)提高腫瘤對(duì)輻射的敏感性,,Rodel等對(duì)三種固有放射

12、敏感性不同的腸癌細(xì)胞株（低度敏感的sw480,中度敏感的HCT-15,高度敏感的sw48)用2和8Gy劑量照射后，集落形成結(jié)果顯示， sw48細(xì)胞株的自發(fā)和輻射誘導(dǎo)的凋亡水平均高于sw480細(xì)胞株，Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，Survivin在sw480細(xì)胞株中的自發(fā)和輻射誘導(dǎo)表達(dá)平均高于sw48細(xì)胞株， HCT-15居中。 Survivin表達(dá)水平與自發(fā)和輻射誘導(dǎo)的凋亡水平成反比，說(shuō)明Survivin自發(fā)凋亡水平可

13、以作為體內(nèi)直腸癌對(duì)放射治療的反應(yīng)指標(biāo)， Survivin的mNA和蛋白水平的測(cè)定可以預(yù)測(cè)直腸癌對(duì)放化療的敏感性,,A sanuma 等對(duì)5 個(gè)不同放射敏感性的胰腺癌細(xì)胞系進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn), 對(duì)X 線輻射抵抗最強(qiáng)的PANC-1 細(xì)胞株中survivin 的mRNA 水平最高, 說(shuō)明檢測(cè)照射前的survivin mRNA水平可以預(yù)測(cè)其放射敏感性; 對(duì)PANC-1 和輻射最敏感的M IA PaCa-2 給予亞致死劑量照射后, survivin

14、mRNA 的表達(dá)水平都有顯著的升高, 伴隨caspase-3 的活性顯著下降, 與致死劑量照射后存活細(xì)胞中的表達(dá)相一致。這一結(jié)果說(shuō)明, survivin 參與了細(xì)胞固有的和放射誘導(dǎo)的放射耐受機(jī)制, 抑制survivin 的mRNA 表達(dá)可能會(huì)提高胰腺癌對(duì)輻射的敏感性。A Sanuma K, Moriar, Yajima T, et al. Survivin as a radioresistance factor in pancreat

15、ic cancer [J ]. Cancer Res, 2000, 91(11) : 1204-1209.,,,Livin是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)凋亡抑制基因，是IAP家族新成員。Livin基因位于人染色體20q13，全長(zhǎng)4.6kb，包含7個(gè)外顯子，基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA長(zhǎng)1.4 kb。,,,Livin（ML-IAP/KIAP）主要在一些腫瘤組織細(xì)胞中高表達(dá)，是抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的重要因素之一，但是其抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用還不明確，可能通過以下一些抗

16、細(xì)胞凋亡作用的途徑。,,,1.抗死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用：2.抗線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用3.抗化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用,,,livin 是怎樣參與了細(xì)胞固有的和放射誘導(dǎo)的放射耐受機(jī)制,目前還不明確，沒有這方面的報(bào)道,,Uchida等[30]構(gòu)建了一種由U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的survivin siRNA腺病毒載體，將其分別轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，同樣觀察到survivin表達(dá)受到明顯抑制，腫瘤細(xì)

17、胞生長(zhǎng)減緩，凋亡細(xì)胞增加。上述研究結(jié)果提示survivin可作為人類多種惡性腫瘤基因治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)， 研究表明,利用RNA 干擾技術(shù),設(shè)計(jì)針對(duì)Livin的特異性siRNA 可以阻斷Livin 基因表達(dá),并且可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性【31,32】。RNAi則有可能成為一種極具潛力的基因治療工具。,,中藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響多項(xiàng)研究表明從中藥中提取的一些有效成分對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有直接抑制作用，能阻止其代謝，降低其分裂增殖能力，下調(diào)凋

18、亡抑制基因表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，改變細(xì)胞周期分布。,,中藥通過細(xì)胞凋亡影響細(xì)胞放射敏感性苦參堿和欖香烯作為治療腫瘤的純中藥已廣泛應(yīng)用于臨床，但是這些臨床報(bào)道并未探究他們作為一種放療增敏劑的增敏機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)旨在研究苦參，欖香烯對(duì)人肺癌細(xì)胞放射敏感性的影響:苦參，欖香烯是否增加人肺癌細(xì)胞的放射敏感性及不同濃度一時(shí)間作用后的增敏效果如何。并進(jìn)一步探討他們的放射增敏的機(jī)制。為放射增敏臨床研究提供新思路和借鑒，為中藥放射增敏研究提供方法,,我

19、們自己的一些工作,,我們已經(jīng)熟練掌握了細(xì)胞培養(yǎng)，RT-PCR, 熒光定量PCR,Westen Blot,，RNAi等多種分子生物學(xué)技術(shù)，以細(xì)胞培養(yǎng)為研究工具已經(jīng)發(fā)表了多篇論文。,本研究中的三種細(xì)胞培養(yǎng)國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道，技術(shù)成熟，本課題組已經(jīng)熟練掌握。完成了江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金《肺癌組織中凋亡抑制基因Livin與多藥耐藥的關(guān)系及臨床應(yīng)用研究》，部分研究成果已經(jīng)發(fā)表在Jpn J Clin Oncol. 2010 （SCI收入. ）

20、。,60例非小細(xì)胞肺癌組織survivin的表達(dá)PCR圖譜,,,60例非小細(xì)胞肺癌組織中 livin的表達(dá)PCR圖譜(圖 1),,,,,1，Survivin，livin蛋白在凋亡信號(hào)通路上的作用機(jī)理。Survivin ，livin表達(dá)水平是否與自發(fā)和輻射誘導(dǎo)的凋亡水平的關(guān)系密切，他們過表達(dá)，是否對(duì)自發(fā)和輻射誘導(dǎo)的凋亡可能有明顯的抑制作用，是否在肺癌細(xì)胞固有的和放射誘導(dǎo)的放射耐受中扮演重要角色。,六、研究目標(biāo)和預(yù)期研究成果,2，Sur

21、vivin ，livin基因RNA干擾后，自發(fā)和輻射誘導(dǎo)的凋亡水平是否明顯增加，肺癌細(xì)胞固有的和放射誘導(dǎo)的放射抵抗是否減弱。Survivin ，livin可否作為肺癌等多種惡性腫瘤基因治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，而RNAi則是否可能成為一種極具潛力的基因治療工具。,3，藥物對(duì)輻射干預(yù)：中藥苦參堿和欖香烯能否通過抑制凋亡抑制因子的表達(dá)，從而增加自發(fā)和輻射誘導(dǎo)的凋亡水平，減少放射誘導(dǎo)的放射耐受，增加腫瘤放射敏感性，獲得治療增益。為肺癌臨床的個(gè)體化治