瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)中內(nèi)源菌污染的防止研究

1、瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)中內(nèi)源菌污染的防止研究,,一、目前主要進行組織培養(yǎng)研究的觀葉草本植物1 天南星科 粗勒草屬 紅葉粗勒草2 天南星科 綠蘿屬 金葉葛、陽光葛、白金葛,紅葉粗肋草可大致分為4類：1）紅脈類：葉脈或近葉脈葉肉呈現(xiàn)紅色，如紅峽、紅龍、邦德、龍焰（煙花）；2）全紅葉類：葉片全部或大部分呈現(xiàn)紅色，如日出；3）花葉類：葉片上呈現(xiàn)不規(guī)則的紅色斑塊或條紋，如日出、如意、貴夫人；4）鑲邊類：葉片邊緣為紅色，如

2、口紅、極光。,紅葉粗肋草系列——貴夫人（吉祥）,紅葉粗肋草系列——如意（火紅萬年青）,紅葉粗肋草系列——日出（狐仙、激情）,紅葉粗肋草系列——燦爛（煙花）,紅葉粗肋草系列——邦德,紅葉粗肋草系列——紅峽,紅葉粗肋草系列——午夜女郎（中國紅）,紅葉粗肋草系列——孔雀開屏,紅葉粗肋草系列——極光（萬年紅）,紅葉粗肋草系列——甜夢,紅葉粗肋草系列——紅龍（中國龍）,其他保存品種（耐寒性能差）,,檸檬美,,口紅,龍焰,綠蘿類,陽光葛,金葉葛,二

3、、瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)中污染的防止,瑪麗安萬年青又名粉黛(Dieffenbachia Camilla)，為天南星科花葉萬年青屬(又名黛粉葉屬)植物。原產(chǎn)南美巴西，喜溫暖、濕潤和半陰環(huán)境，它為多年生常綠草本。莖多肉質(zhì)，葉卵狀橢圓形、寬大，綠色葉片嵌入黃、白色斑，優(yōu)美高雅，1996年從國外引進，是室內(nèi)裝飾的重要觀葉植物。,黛粉葉葉片大，具有美麗的色斑，適合盆栽觀賞，點綴客廳、書房，清新大方，十分舒泰、幽雅。用它擺放光度較低的公共場所，黛粉

4、葉仍然生長正常，碧葉青青，枝繁葉茂，充滿生機，特別適合在現(xiàn)代建筑中配置。,在植物的組織培養(yǎng)過程中，存在兩種類型的污染，一是通常講的污染，即因外植體消毒不徹底、無菌操作和培養(yǎng)過程中如培養(yǎng)基、接種工具、接種室消毒不嚴(yán)格或操作不規(guī)范而導(dǎo)致的污染，見圖1-4。還有一類是內(nèi)源菌污染。那些生長在高溫多雨的熱帶、亞熱帶植物和多年生木本植物容易表現(xiàn)內(nèi)源細(xì)菌污染。內(nèi)源細(xì)菌不能被一般的表面消毒方法所消除，若未能對其有效的消除，它將隨著材料進入培養(yǎng)過程，引

5、起不同程度的污染，產(chǎn)生程度不一的危害。在早期往往會導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，增殖率降低，培養(yǎng)物生長減緩，玻璃化苗增加等;后期則導(dǎo)致試管苗移栽困難和死亡。有時污染還會引起培養(yǎng)物的遺傳變異。,賽雷氏桿菌,圖1,水跡狀,圖2,粘液狀,圖3,發(fā)泡狀,圖4,天南星科黛粉葉屬的瑪麗安萬年青在莖段培養(yǎng)中特別容易污染，我們以其作為試材，通過預(yù)培養(yǎng)、減壓滅菌和在培養(yǎng)基加入不同種類的抗生素、不同濃度及不同濃度的組合處理，進行篩選研究，以期找到防止外植體內(nèi)源細(xì)菌污染的有

6、效方法。,1 材料和方法,1.1 材料 天南星科（Araceae）黛粉葉屬瑪麗安萬年青（Dieffenbachia amoena 'Camilla'.），取自于仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教學(xué)科研基地。1.2 方法 用手術(shù)刀將瑪麗安萬年青的葉片剝?nèi)ィ冻鲆秆?，用自來水沖洗干凈后用肥皂水沖洗1次，再用自來水浸泡2-3h后沖洗干凈，涼干。1.3 培養(yǎng)基的制備 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑，蔗糖2%，瓊脂6%，p

7、H5.8。1.4 消毒滅菌1.4.1外植體常規(guī)消毒 用75%的酒精浸泡1min，無菌水沖洗1-2次，再用0.1% HgCl2浸泡15min，無菌水沖洗3-5次。,1.4.2 外植體的預(yù)培養(yǎng) 將洗干凈的外植體分別置于5種濃度均為500 mg.L-1的抗菌素溶液中并在搖床上振蕩1 d，取出用自來水沖洗干凈，其他方法步驟同1.4.1。1.4.3 抗菌素預(yù)培養(yǎng)濃度的篩選 選出預(yù)處理中表現(xiàn)最好的一種抗菌素，分別于培養(yǎng)基中加入不同濃度的抗菌素

8、對外植體進行1 d的預(yù)培養(yǎng)，其他方法步驟同1.4.1。,1.4.4 減壓滅菌常規(guī)減壓滅菌：用 0.1% HgCl2減壓抽濾（真空壓力為018 kg.cm-2，下同）8 min，以無菌水沖洗1~2次，再用0.1% HgCl2浸泡5 min，無菌水沖洗3~5次后接種。加入抗菌素的減壓滅菌：配制濃度均為500 mg.L-1的5種抗菌素（其中ANB1、ANB2分別由江西東方制藥廠和上海嘉善善生藥業(yè)有限公司出品，其他為市售），分別與0.1%

9、 HgCl2的混合，將外植體置于溶液中進行減壓8 min，無菌水沖洗1~2次，再用0.1% HgCl2浸泡5 min，無菌水沖洗3~5次后接種。,1.4.5 抗生素減壓過濾滅菌 由于抗生素在高溫高壓下易分解，應(yīng)采取減壓過濾滅菌。將配制濃度為50mg.L-1的氨芐青霉素（ampicillin）、氯霉素（chloramphenicol）、利福平（rifampin）、慶大霉素（gentamycin）、鏈霉素（streptomycin）、先鋒霉

10、素6號（cefradine）和卡拉霉素（kanamycin）7種抗生素在超凈工作臺用已滅菌的注射器和一次性濾器進行過濾滅菌，然后加入尚未凝固的培養(yǎng)基中。一次性濾器采用Gelman Laboratory 生產(chǎn)的孔徑為0.2μm濾器。1.4.6 抗生素濃度的篩選 選出第一階段培養(yǎng)中表現(xiàn)最好的兩種抗生素利福平和氯霉素，設(shè)定不同的濃度0 mg.L-1、50mg.L-1、100mg.L-1、150mg.L-1，進行最佳濃度的篩選。,1.4.7

11、 不同利福平和氯霉素濃度組合的篩選 以50mg.L-1利福平作對照，設(shè)計25mg.L-1利福平+25mg.L-1氯霉素、25mg.L-1利福平+50mg.L-1氯霉素、50mg.L-1利福平+25mg.L-1氯霉素和50mg.L-1利福平+50mg.L-1氯霉素4種組合，進行最佳濃度組合篩選。1.5 培養(yǎng)條件與統(tǒng)計 培養(yǎng)室溫度25-28℃，光照2000-4000lx，每天光照12-14h，20d后觀察統(tǒng)計。數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟

12、件分析處理。,過濾滅菌,2 結(jié)果與分析,2.1 瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)中內(nèi)源菌污染癥狀 經(jīng)過嚴(yán)格的常規(guī)消毒，瑪麗安萬年青莖段初代培養(yǎng)中仍然存在嚴(yán)重的污染。有些污染并不形成明顯的菌落，而只在培養(yǎng)基內(nèi)部形成“絲狀物”或“暈狀物”，不容易被肉眼察覺，如不仔細(xì)觀察很容易被忽視，只在背光檢查時才易被發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，菌量逐漸累積，才在培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來，見圖6。,A,B,,,,,圖6 瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)中內(nèi)源菌污染癥狀（A絲狀，B暈

13、圈狀）,2.2 外植體的預(yù)處理對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的效果 采用ANB1和ANB2處理材料所取得的效果較好，未污染率和成活率都比較高，都達到50%以上。其中ANB2的未污染率達到76.7%、成活率為50.0%（表1），說明ANB2這種抗生素能比較有效地抑制外植體內(nèi)源細(xì)菌的污染。,表1 不同抗生素預(yù)處理對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的影響,2.3 減壓抽濾對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的效果 采用0.1% HgCl2浸泡，

14、減壓滅菌8 min，再用0.1% HgCl2消毒材料，未污染率為60.0%，成活率為43.3%，效果優(yōu)于常規(guī)消毒（表2）。,表2 常規(guī)消毒與減壓抽濾對瑪麗安萬年青莖段污染防止效果的比較,2.4加入抗生素后減壓滅菌對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的效果 加入不同抗生素后進行真空減壓滅菌，對污染防止的效果低于對照，實驗中還觀察到有的組合起化學(xué)反應(yīng)，從而影響了抑菌的效果（表3）。,表3 0.1% HgCl2分別與不同抗生素進行真空減壓滅菌對

15、瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的效果,2.5 ANB2抗菌素預(yù)處理濃度對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的效果以300、400、500 mg.L-1的ANB2預(yù)處理，3種濃度的抑菌效果相比差異不明顯（表4）。但從使用成本角度出發(fā)，300 mg.L-1的ANB2比較經(jīng)濟。,表4 不同ANB2預(yù)處理濃度對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的效果,2.6不同抗生素種類對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的影響結(jié)果表明（見表5），氯霉素和利福平處理材料后的未

16、污染率和成活率都比較高，與CK、慶大霉素、卡拉霉素、鏈霉素、青霉素、先鋒霉素等處理比較均達到了極顯著水平。其中，利福平的未污染率從對照的19.45%上升到68.42%，成活率從16.67%上升到65.79%，說明利福平和氯霉素均能較有效地抑制內(nèi)源細(xì)菌的污染，而其他抗生素的效果較差，特別是慶大霉素的處理與對照相似。,表5不同抗生素種類對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的影響（濃度均為50mg.L-1）,注：*方差分析中小寫字母表示0.05（顯

17、著）水平;大寫字母表示0.01（極顯著）水平，下同.,2.7不同濃度的氯霉素、利福平對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的效果 從表6可以看出，隨氯霉素（縮寫為Chl.）和利福平（縮寫為Rif.）濃度的增加，未污染率和成活率均有增加的趨勢，當(dāng)利福平的濃度為150mg.L-1時的未污染率和成活率都達到76.92%，而氯霉素濃度為150mg.L-1時對污染的防止效果達64.10%。,表6 不同濃度的氯霉素、利福平對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染

18、防止的效果,2.8不同濃度的氯霉素、利福平組合對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的效果從表7 可以看出，當(dāng)氯霉素濃度達到50mg.L-1時，不論利福平濃度是25mg.L-1還是50mg.L-1，防止污染的效果與成活情況均極顯著地高于利福平單獨處理；而當(dāng)氯霉素濃度為25mg.L-1時，不管利福平濃度是25mg.L-1還是50mg.L-1，防止污染的效果與成活情況都與對照沒有顯著性差異。因此，加入培養(yǎng)基的氯霉素濃度應(yīng)不低于50mg.L-1。,

19、表7 不同濃度的氯霉素、利福平組合對瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)污染防止的影響,3討論,內(nèi)源細(xì)菌污染在植物組織培養(yǎng)中較難解決，無論用何種表面消毒方法都無法徹底消除外植體的內(nèi)生細(xì)菌，在培養(yǎng)基加入抗生素是防止內(nèi)源細(xì)菌污染的有效措施之一。我們的實驗結(jié)果表明，預(yù)處理中ANB2的抑菌效果優(yōu)于其他抗生素， 添加濃度分別為300、400和500 mg.L-1 的ANB2對材料抑菌效果沒有明顯的差異，從成本上看，一般應(yīng)選用300 mg.L-1的ANB2;對較

20、難滅菌或組織較老的材料可使用較高濃度，而對于組織較嫩的材料則可使用稍低一些的濃度；進行減壓處理相對于常規(guī)處理有明顯的抑菌效果，但加入抗生素后再進行減壓處理，抗生素則未能取得明顯的效果，并對外植體有殺死作用；在7種抗生素中以利福平和氯霉素防止污染效果較好，利福平和氯霉素的濃度均為150mg.L-1時污染防止的效果最佳。,至于使用哪種抗生素為好、使用濃度多少為適宜？可能因植物的種類不同、植物所含內(nèi)生菌種類的不同以及抗生素使用的種類和濃度不同

21、，導(dǎo)致抗生素使用的效果變化很大]。如報道的500mg.L-1頭孢噻肟（cefoxitin）、10 mg.L-1阿霉素（amycacin）、30 mg.L-1利福平、50mg.ml-1卡拉霉素、先鋒霉素、鏈霉素、慶大霉素、林可霉素，分別有效地抑制各培養(yǎng)中的細(xì)菌污染。我們發(fā)現(xiàn)，25mg.L-1利福平+50mg.L-1氯霉素和50mg.L-1利福平+50mg.L-1氯霉素組合，防止污染的效果比利福平單獨處理有很大的提高，與翟建中、Reed的

22、結(jié)果相似。表明在培養(yǎng)基中使用兩種或兩種以上抗生素，可以防治細(xì)菌的抗藥性，有時效果比單獨使用時更好。,參考文獻,[1] 周俊輝.植物快速繁殖技術(shù)中存在的問題與對策[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報, 1999,12(4):64- 70.[2] LEIFERT C,WAITES W M. Contaminants of plant tissue cultures[J]. Int Assoc Plant Tissue Culture Newsl,

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