第八節(jié) 基因工程藥物的分離純化

1、第八節(jié) 基因工程藥物的分離純化,基因工程藥物的分離、純化非常重要。表達的產物都是多肽或蛋白質 。它的制得具有以下 特點：①表達產物在初始料中含量較低；,,②含有大量細胞及代謝產物；③表達產物穩(wěn)定性差，易失活變性；④表達產物的種類繁多、結構不一、活性各異；⑤對其質量要求純度高、無菌、無熱原。,一、建立分離純化工藝的根據(jù),⒈含目的產物的起始料的特點 基因工程菌的發(fā)酵產物其上游過程的各種因素對分離、純化工藝有影響。包括：

2、　?、倬N的類型及其代謝特性?！　、谠牧吓囵B(yǎng)基的來源及其質量。　?、凵a工藝及條件。,,⒉物料中雜質的種類和性質?！　　、衬康漠a物特性?！　　、串a品質量的要求,二 、分離純化的基本過程,發(fā)酵液 細胞分離胞內產物 胞外產物 細胞破碎 固液分離 濃縮 初步分離 高度純化 制劑 產品包含體

3、 細胞碎片分離 變性 復性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,三、分離純化的技術,分離純化的技術要求：①技術條件溫和能保持產物生物活性。②選擇性好，能從復雜的混合物中有效的將目的產物分離，達到較高的純化倍數(shù)。,,③收率要高。④兩個技數(shù)間能直接銜接， 不需要對物料加以處理。⑤純化過程要快，滿足高 生產率的要求。,,⒈細胞破碎與固液分離 ⑴細胞收集： 離心法、膜分離法。 ⑵細胞破碎：

4、機械破碎法、非機械破碎法。 ⑶固液分離,⒉目的產物的分離純化,目的產物含有大量雜質必須進行分離純化。 蛋白質分離純化方法的設計根據(jù)其分子的理化性質和生物學特性來決定。,,產 物 特 性 　　作 用,,,,,等電點 　決定離子交換種類及條件　相對分子量 選擇不同孔徑的介質　疏水性

5、 與疏水、反相介質結合的程度　生物特異性 決定親和配基　溶解性 決定分離體系及蛋白濃度　穩(wěn)定性 決定工藝采用溫度及流程時間,,⒉目的產物的分離純化,目的產物含有大量雜質必須進行分離純化。 蛋白質分離純化方法的設計根據(jù)其分子的理化性質和生物學特性來決定。,,產 物 特 性

6、 　作 用 等電點 決定離子交換種類及條件　相對分子量 選擇不同孔徑的介質　疏水性 與疏水、反相介質結合的程度　生物特異性 決定親和配基　溶解性 決定分離體系及蛋白濃度　穩(wěn)定性 決定工藝采用溫

7、度及流程時間,,,,,,產物的特性在分離純化中的作用,分離純化的方法依賴色譜分離方法,⑴離子交換層析（ ion exchange chromatography IEC） 離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換，從而達到分離的目的。 它具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質核酸分離純化的重要方法。,⑵反相色譜（reversed phase chromatography，RPC）和

8、 疏水色譜（hydrophobic interaction chromatography，HIC）,反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質疏水性的差異來分離純化的。 反相色譜是利用溶質分子中非極性基團與非極性固定相之間相互作用力的大小以及溶質分子中極性基團與流動相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進行分離的。,,常用固定相為硅膠烷基鍵合相。 流動相為低離子強度的酸性水溶液，加入能與水互溶的乙腈、甲醇、異丙醇等有機溶劑。

9、由于固定相骨架疏水性強，吸附的蛋白質需用有機溶劑才能洗脫下來。,,疏水色譜的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質分子表面上的疏水區(qū)域和介質中的疏水基團之間的相互作用，無機鹽的存在能使相互作用力增強。 固定相介質表面的疏水性比反相色譜介質表面的疏水性弱。為有機聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。 流動相為pH6～8鹽水溶液。,,在高鹽濃度時，蛋白質分子中疏水性部分與介子的疏水基團產生疏水性作用而被吸

10、附；鹽濃度降低時蛋白質疏水性作用減弱，目的蛋白質被逐步洗脫下來，蛋白質疏水性越強，洗脫時間越長。 與反相色譜相比，疏水色譜回收率較高，蛋白質變性可能性小。,⑶親和層析（affinity chromatography，AC）,親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質之間特異的生物親和力進行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。,,配基：在親和層析中起可逆性結 合的特異性物質。 載體：與配基結合的支撐

11、物。 親和層析大體可分三步：　　　①配基固定化　　?、谖侥康奈铩　　、蹣悠方馕?⑷凝膠過濾,凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質，小分子能進入孔內，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內，快速移動，利用這種移動差別可使大分子與小分子分開。,,根據(jù)蛋白質的相對分子量和蛋白質分子的動力學體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。 主要應用兩個方面： ①脫鹽和更換緩沖液 ②蛋白質分子的分級分離?！≡诋a品

12、的形成階段前用于除去產物的多聚體及降解產物。,⒊非蛋白質雜質的去除,DNA、熱原質和病毒的純化方法：⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質為強酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⑵熱原質的去除 熱原質是腸桿菌科產生的細菌內毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離

13、子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除 層析或過濾可將病毒去除。,⒊非蛋白質雜質的去除,DNA、熱原質和病毒的純化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質為強酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。,,⑵熱原質的去除 熱原質是腸桿菌科產生的細菌內毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質

14、中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除 層析或過濾可將病毒去除。,四、選擇分離純化方法的依據(jù),⒈根據(jù)產物表達形式來選擇 分泌型表達產物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低純化前必須濃縮可用沉淀和超濾法。,,產物在周質表達是介于細胞內可溶性表達和分泌表達的一種形式,它可以避開可溶性表達蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質,在一定程度上有利于分離純化.為了獲得周質蛋白 經低濃度溶菌

15、酶處理后,可采用滲透壓休克的方法來獲得。,,可溶性表達產物破菌后的細胞上清，首選親和分離方法，或離子交換層析。,⒉根據(jù)分離單元之間的銜接選擇,應選擇不同機制的分離單元組成一套分離工藝，盡早采用高效的分離手段。 先將最多的雜質去除，將費用最高、最費時的分離單元放在最后階段，即通常先運用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀超濾和吸附等），以盡快縮小樣品體積，提高產物濃度，去除最主要雜質（包括非蛋白類雜質）。,,隨后采用高分辨率的操作單元（

16、離子交換層析和親和層析）凝膠過濾放在最后，這樣可以提高分離效果。 層析分離次序的選擇同樣重要，合理的組合能提高分辨效率，并有利于各步驟間的過渡。如離子交換層析、親和層析、凝膠過濾。,⒊根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇,分離純化工藝應遵循以下原則： ⑴具有良好的穩(wěn)定性和重復性 ⑵盡可能減少組成工藝的步驟 ⑶各技術步驟間要相互適應和協(xié)調,,⑷工藝過程中盡可能少用試劑