lfy類基因在莖端分生組織形成及其活動中的作用

1、北京大學(xué)政學(xué)者論文集（2001年）LFY類基因在莖端分子組織形成及其活動中的作用378LFYLFY類基因在莖端分生組織形成及其活動中的作用類基因在莖端分生組織形成及其活動中的作用ExpressionPatternofLFYlikeGeneitsFunctioninShootApicalMeristemActivity98級生命科學(xué)學(xué)院細胞生物與遺傳學(xué)系劉曼摘要LFY類基因在植物形態(tài)建成過程中具有重要作用，根據(jù)其突變體的特征，曾一度被認

2、為是在花分生組織和花序分生組織中特異表達的“分生組織特征決定基因”，控制花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其在營養(yǎng)分生組織甚至胚胎發(fā)生過程中都有所表達。本實驗試圖通過啟動子活動特點研究、mRNA水平上原位雜交分析等各種方法，對其功能進行深入地探討，以期全面地認識該類基因在植物發(fā)育中的作用。AbstractAbstractLFYlikegenesplayimptantroleinplantdevelopmentwh

3、entheywerefirstisolatedfrommutantsofAntirrhinumArabidopsistheywerethoughttobe“SAMspecificdeterminatinggenes”regulatingthetransitionfrominflescencetoflowermeristem.HoweverfurtherresearchrevealedthatLFYlikegenes’activityca

4、nbefoundinembryogenesisshootapicesaxillarybudsatdifferentstagesaswellasinflowerprimdial.WeacterizedLFYpromoter’sactivityinvestigatedLFYmRNAexpressionwith北京大學(xué)政學(xué)者論文集（2001年）LFY類基因在莖端分子組織形成及其活動中的作用380聯(lián)。但是，有研究表明，以GUS等報告基因所顯示

5、的啟動子活動模式可能并不一定反映該啟動子對其原有基因表達的時空調(diào)節(jié)模式。因為基因的表達不單需要啟動子的活動，還和一些其他因子，例如內(nèi)含子等有關(guān)。因此，要真正了解LFY基因在分生組織形成與活動過程中的表達特點，還應(yīng)有對其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即mRNA進行原位檢測的證據(jù)。本課題即是在本實驗室過去工作的基礎(chǔ)上，試圖從正常植株與組培過程再生植株中LFY啟動子活動方式的檢測和LFY基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的直接檢測兩個方面，對LFY類基因早期表達特點及其可能的功能等關(guān)鍵

6、問題進行進一步地探討。本課題研究中主要涉及兩種基因表達的檢測技術(shù)。當研究LFY啟動子活動方式時，我們采用報告基因的表達分析方法。報告基因通常編碼一個在離體條件下易于檢測的酶，或者編碼可以在活體條件下進行組織化學(xué)定位的蛋白，這樣就可以提供基因表達定量的和定性的信息。gusA基因是從大腸桿菌（Escherichiacoli）中分離出來的，并且目前有一些基因盒可以允許在gusA基因的附近插入啟動子區(qū)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄融合基因或翻譯融合基因。我們實驗所

7、用的Plfy::GUS擬南芥和Plfy::GUS煙草、Pnfl::GUS煙草即是在gusA基因前插入LFY或NFL基因的啟動子（Plfy或Pnfl），當Plfy或Pnfl活動時，帶動gusA表達，利用一個簡單的組織化學(xué)檢測就可以精確地分析gusA融合基因的時空表達模式。用5溴4氯3吲哚葡糖苷酸（Xgluc）作為底物可以精確地進行GUS活性的定位，這一反應(yīng)分兩步進行：首先是切割葡糖醛酸部分，產(chǎn)生無色的吲哚氧基中間產(chǎn)物，隨后吲哚氧基中間產(chǎn)物

8、氧化成為不溶的藍色沉淀。用GUS進行這類實驗有如下優(yōu)點：（1）在大多數(shù)植物組織中GUS活性的本底低；（2）反應(yīng)產(chǎn)物不擴散，在表達基因的植物細胞內(nèi)積累；（3）通過簡單的擴散或真空滲入，底物易被植物細胞吸收。當然，也存在一些缺點：（1）組織化學(xué)染色后植物失去繼續(xù)培養(yǎng)的可能，這樣不能跟蹤檢測同一株植物不同時期的基因活動情況；（2）由于酶和產(chǎn)物非常穩(wěn)定，因而不能真實的反映出GUS替代的那個蛋白在穩(wěn)定狀態(tài)下的豐度；（3）人們發(fā)現(xiàn)在GUS表達水平很

9、高的組織中會發(fā)生無色反應(yīng)中間產(chǎn)物滲漏的現(xiàn)象，但是，這可以通過在底物溶液中加入氧化劑高鐵氰化鉀或亞鐵氰化鉀或者二者都加（終濃度為5mmolL），來使這種滲漏減至最少（Stomp1990Masarenhas和Hamilton1992）；（4）同所有的組織化學(xué)方法一樣，其檢測結(jié)果不是定量的。而且，最致命的缺點是，啟動子的分析不一定總能反映基因的真實活動情況（如前文所述），這是在運用報告基因方法進行基因表達特征分析時必須注意的一個問題。當檢測L

10、FY基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時，我們用到了原位雜交（insituHybridization簡稱ISH）技術(shù)。該技術(shù)最早是由Gall和Pardue(1969)及John等(1969)獨立發(fā)明的。其基本原理是根據(jù)核酸分子堿基互補配對的原則（ATCG）將有放射性或非放射性標記的外源核酸(探針：Probe)與染色體上經(jīng)過變性后的單鏈DNA互補配對結(jié)合成專一的核酸雜交分子再經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在染色體上的位置顯示出來。我們采用的mRNA水平的原位雜交