囊胚培養(yǎng)技術(shù)

1、囊胚培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)展,,受精卵一旦形成，隨即啟動卵裂機(jī)制。在第3、4天時受精卵已分裂為約100個細(xì)胞的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。經(jīng)輸卵管蠕動細(xì)胞團(tuán)被送入子宮腔，通過表面粘性物，貼附與子宮內(nèi)膜，靠近子宮內(nèi)膜的細(xì)胞分泌一種酶，將子宮內(nèi)膜細(xì)胞裂解，形成一個小洞，從受精后的5、6天開始至第11、12天，整個胚泡埋入內(nèi)膜，該過程稱為“著床”或“植入“。胚泡植入后，子宮內(nèi)膜重新長好，胚泡表面的滋養(yǎng)層細(xì)胞不斷分裂，長出絨毛狀突起，形成許多絨毛，伸入子宮內(nèi)膜，吸收母體營

2、養(yǎng),胚胎培養(yǎng)：將卵泡液中撿出的成熟卵細(xì)胞洗滌后，置于含人血清白蛋白的授精液中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6 h后授精。授精后16-18 h轉(zhuǎn)移入卵裂培養(yǎng)液中，觀察受精情況，記錄原核情況。第3天時觀察胚胎的發(fā)育情況，記錄胚胎的卵裂球數(shù)及分級。囊胚培養(yǎng)：胚胎移入預(yù)先平衡好的囊胚培養(yǎng)液中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后觀察囊胚形成情況。,胚胎早期培養(yǎng),發(fā)育阻斷,在離體培養(yǎng)哺乳類（包括人）受

3、精卵時人們發(fā)現(xiàn)，在一些化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中，受精卵往往不能發(fā)育到囊胚，而是停頓在某個特定的發(fā)育時期。這種現(xiàn)象被稱作“發(fā)育阻斷”。發(fā)育阻滯的時期隨物種不同而異，例如，大鼠和小鼠的發(fā)育阻滯發(fā)生在2細(xì)胞期以后，人發(fā)生在4-8細(xì)胞期，牛、羊等發(fā)生在8-16細(xì)胞期，兔發(fā)生在桑葚胚期。,普通胚胎移植大多數(shù)試管嬰兒中心選擇第3天胚胎來移植，胚胎已發(fā)育到8細(xì)胞。在IVF中，囊胚培養(yǎng)是“胚胎體外培養(yǎng)”的終末階段，它通常形成于卵子受精后的第5-

4、6天。自然生理狀態(tài)下，早期胚胎在輸卵管中發(fā)育，直到接近囊胚期才進(jìn)入子宮。因此，利用體外培養(yǎng)技術(shù)將胚胎培養(yǎng)至囊胚期再植回子宮腔，能獲得較高的胚胎植入率。,囊胚移植的優(yōu)勢,(1)使胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜/種植窗同步,更符合生理著床時間,從而提高IVF-ET的胚胎種植率,同時可提高臨床妊娠率并減少胚胎移植數(shù)量,進(jìn)一步降低多胎妊娠率;(2)進(jìn)一步淘汰具有遺傳缺陷、無發(fā)育潛能的胚胎,使可供移植的胚胎得到篩選;(3)縮短了胚胎移植入子宮腔后進(jìn)一步發(fā)

5、育與著床之間的間隔,且子宮收縮逐漸減少,可減少胚胎排出體外的機(jī)會,有利于胚胎著床;,(4)為分裂期胚胎活檢,進(jìn)入植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)提供時間,另外,可直接對囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢,由于提供了較多的細(xì)胞來源,進(jìn)而提高了診斷的準(zhǔn)確性;(5)為人胚胎胚胎干細(xì)胞技術(shù)研究提供細(xì)胞來源。因此,囊胚培養(yǎng)和單囊胚移植已成為許多生殖中心提高妊娠率,并降低多胎發(fā)生率的重要手段之一。,,,囊胚培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,共培養(yǎng)技術(shù)及作用機(jī)理,共培養(yǎng)：是指在胚胎

6、體外發(fā)育的培養(yǎng)液中加入一些體細(xì)胞作為營養(yǎng)細(xì)胞與胚胎一起培養(yǎng)，如輸卵管上皮細(xì)胞或子宮上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)等，建立共培養(yǎng)體系以促進(jìn)胚胎發(fā)育，克服胚胎體外發(fā)育阻斷，提高胚胎移植率。第一，在胚胎發(fā)育過程中能自分泌或旁分泌一些對早期胚胎有利的物質(zhì)，研究最多的是生長因子；第二，共培養(yǎng)體系可代謝降解或除去培養(yǎng)液中胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的胚胎毒性因子，如銨、次黃嘌呤和氧自由基等等；第三，共培養(yǎng)細(xì)胞可能通過體細(xì)胞與胚胎的直接接觸促進(jìn)胚胎發(fā)育。,輸卵管上皮細(xì)

7、胞共培養(yǎng)技術(shù),卵母細(xì)胞由卵巢排出后在輸卵管壺腹部受精形成受精卵，輸卵管可以分泌活性因子刺激胚胎發(fā)育，因此使用輸卵管上皮細(xì)胞特別是輸卵管壺腹部上皮與早期胚胎進(jìn)行共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)的自然環(huán)境， 有利于早期胚胎的生長發(fā)育，使更多的胚胎發(fā)育至囊胚階段。人輸卵管上皮細(xì)胞是最早應(yīng)用于臨床的共培養(yǎng)細(xì)胞，1989 年 Bongso 等報(bào)道，利用人輸卵管上皮與人胚胎共培養(yǎng)提高囊胚形成率。 Khatir 等的研究顯示，輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)比顆粒細(xì)胞共

8、培養(yǎng)更適合體外胚胎發(fā)育。,子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù),胚胎在輸卵管發(fā)育很短時間后進(jìn)入子宮，子宮是胚胎發(fā)育的最終場所，因此亦有許多胚胎共培養(yǎng)體系以子宮內(nèi)膜細(xì)胞為輔助細(xì)胞。 子宮內(nèi)膜可以分泌許多活性因子，如白血病抑制因子（LIF）、表皮生長因子（EGF）及許多細(xì)胞因子和黏附分子，這些物質(zhì)均能有效提高胚胎的發(fā)育率和質(zhì)量。研究顯示，利用人自體子宮內(nèi)膜細(xì)胞 （含基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞） 做飼養(yǎng)層與人 IVF 胚胎共培養(yǎng)與其在傳統(tǒng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)相比，胚胎

9、細(xì)胞數(shù)顯著增加，胞質(zhì)碎片率明顯下降，培養(yǎng)至囊胚階段胚胎數(shù)增加，種植率和妊娠率提高。動物試驗(yàn)還顯示，子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)可增加囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)， 減少細(xì)胞凋亡，從細(xì)胞生物學(xué)水平證明共培養(yǎng)可以提高胚胎發(fā)育潛力。最近有研究顯示，子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)比序貫培養(yǎng)能提高囊胚形成率、胚胎種植率和臨床妊娠率。 說明共培養(yǎng)體系可以在體外為胚胎發(fā)育提供一種更類似于體內(nèi)的環(huán)境。,卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù),卵母細(xì)胞調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的新陳代謝，而其所需的營養(yǎng)物質(zhì)依賴卵

10、丘細(xì)胞提供，兩者間還通過縫隙連接進(jìn)行信號傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長和成熟。應(yīng)用自體卵丘細(xì)胞與 IVF 得到的早期胚胎共培養(yǎng)，可改善胚胎質(zhì)量，提高妊娠率。顆粒細(xì)胞：卵泡(follicle)中卵母細(xì)胞四周有一層菱形或扁平細(xì)胞圍繞，在卵泡開始發(fā)育、卵細(xì)胞成長的同時，周圍的菱形細(xì)胞變?yōu)榱⒎叫危⒂蓡螌釉錾蓮?fù)層:①顆粒細(xì)胞進(jìn)入宮腔后繼續(xù)分泌生長因子輔助胚胎著床。②顆粒細(xì)胞生長發(fā)育形成樹枝狀結(jié)構(gòu)固定胚胎，增加胚胎在宮腔內(nèi)的黏著性。,Par

11、ikh 等首次應(yīng)用顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)-共移植技術(shù)，將一定數(shù)量的共培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞和胚胎一起移植入子宮，提高了種植率、妊娠率和多胎率。Ebner 等改變了在行胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）前去除卵子周圍全部顆粒細(xì)胞的傳統(tǒng)方法，而在 ICSI 時保留部分顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，改善胚胎質(zhì)量，提高囊胚形成率，該項(xiàng)研究從另一種角度證實(shí)顆粒細(xì)胞在胚胎發(fā)育過程中的不可或缺的重要作用。顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)體系促進(jìn)胚胎體外發(fā)育的作用已得到肯定，但卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)的效果受諸

12、多因素的影響，如卵丘細(xì)胞密度、成熟度等。,序貫培養(yǎng),序貫培養(yǎng)是按照體外培養(yǎng)胚胎在不同發(fā)育時期代謝需求不同,配制成階段系列培養(yǎng)液,進(jìn)行序列更換,從而延長胚胎在體外的培養(yǎng)時間。培養(yǎng)流程:d 0日使用HTF液+10%人血清(HS)進(jìn)行培養(yǎng),d 1日觀察受精情況,更換P1液+10% HS,若受精卵數(shù)3個則更換Blasto-cyst液(B液) +10%HS,培養(yǎng)至d 5日(授精后90~96 h)選取擴(kuò)張囊胚(囊胚腔>1/2胚胎體積)移植。

13、所用培養(yǎng)液均于使用前1 d配制,放入37℃、5%二氧化碳條件下平衡過夜。優(yōu)質(zhì)胚胎判斷標(biāo)準(zhǔn):卵裂球規(guī)整,胞質(zhì)均勻細(xì)膩,無核碎片<10%。,胚胎從受精卵至2-4細(xì)胞階段,以消耗丙酮酸為主,在無糖及磷酸鹽條件下發(fā)育得更好;卵裂球擠緊以后,其代謝模式由三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?需要培養(yǎng)液中糖的存在。HTF液是按照輸卵管液成分配制的簡單培養(yǎng)液,含葡萄糖、磷酸鹽、丙酮酸鈉與乳酸鈉;P1液為不含糖與磷酸根離子、含丙酮酸鈉與乳酸鈉的簡單培養(yǎng)液;

14、B液為含糖、多種氨基酸與維生素的復(fù)雜培養(yǎng)液。由于序貫培養(yǎng)換液次數(shù)多,受外界環(huán)境影響大,污染機(jī)會相對較多,故必需有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控程序與無菌操作做基礎(chǔ),盡可能減少對胚胎的影響。,貫序聯(lián)合子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng),囊胚培養(yǎng)液與子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)。聯(lián)合培養(yǎng)前 將子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于 培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 80% －90% 融合后，將子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液換成已配制好且經(jīng)過平衡過夜 的 囊 胚 培 養(yǎng) 液。再將D3 胚胎置于融合后的內(nèi)膜細(xì)胞上，

15、培養(yǎng)液每 48h 更換。,廢棄胚胎體外培養(yǎng)仍能發(fā)育至囊胚階段; 序貫聯(lián)合子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，與單純的體外序貫培養(yǎng)相比，其囊胚形成率更高，是進(jìn)行廢胚繼續(xù)體外培養(yǎng)的更有效方法.分析原因可能在于:①子宮內(nèi)膜細(xì)胞可分泌一些生長因子和蛋白等，如白細(xì)胞介素 ( IL - 1、6等)、胰島素生長因子(IGF)等，對早期胚胎生長發(fā)育有利。②共培養(yǎng)系統(tǒng)可以代謝降解胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，如螯合重金屬離子、銨、次黃嘌呤和氧自由基等，使胚胎得

16、以更好發(fā)育。③將胚胎與子宮內(nèi)膜共培養(yǎng)，更接近體內(nèi)胚胎自然生長環(huán)境，使胚胎能夠更好的接受各種旁分泌和自分泌信號的調(diào)節(jié)。④序貫培養(yǎng)為不同發(fā)育時期的胚胎提供適合其代謝需求的培養(yǎng)液，結(jié)合子宮內(nèi)膜細(xì)胞為胚胎發(fā)育提供的促生長因子及生理環(huán)境，并減少胚胎發(fā)育中的不利因素，二者聯(lián)合應(yīng)用，為胚胎體外發(fā)育提供更多有利條件。,子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)聯(lián)合序貫成組培養(yǎng)對人早期冷凍時限較長的胚胎發(fā)育具有積極的支持作用，可為充分利用寶貴資源進(jìn)行胚胎實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控、胚胎干細(xì)

17、胞研究等領(lǐng)域提供支持性方案。,囊胚培養(yǎng)的缺點(diǎn),囊胚培養(yǎng)要求條件高，由于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件或胚胎自身原因，胚胎可能會停止發(fā)育或退化，導(dǎo)致沒有胚胎可移植。不能浪費(fèi)較多的卵裂期胚胎：由于體外培養(yǎng)環(huán)境終究不是體內(nèi)自然環(huán)境，延長培養(yǎng)時間，可能使一部分能夠著床的卵裂期胚胎退化。,適宜人群,如染色體異?；颊叩刃枰雠咛セ顧z的患者，在完成活檢后，進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的同時等待PGD結(jié)果。因?yàn)槟承┰蚨枰獣壕徟咛ヒ浦?，但是依然希望能夠移植新鮮胚胎的患者，就可以