利用大鼠iPSCs和囊胚互補(bǔ)技術(shù)再生肺器官的研究.pdf

1、目的:本課題旨在利用大鼠的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(rat induced pluripotent stem cells，rat iPSCs)技術(shù)和囊胚互補(bǔ)技術(shù)在TTF-1基因敲除的小鼠模型上驗(yàn)證異種間肺器官再生的可行性。并為最終在豬、猴等大動(dòng)物體內(nèi)培育出人源化的肺器官奠定基礎(chǔ)。
　　方法:(1)利用N2B27+2i（PD0325901，CHIR99021）的培養(yǎng)體系培養(yǎng)和維持EGFP標(biāo)記的大鼠iPSCs。(2)采用堿性磷酸酶染色、RT-

2、PCR、細(xì)胞免疫熒光、畸胎瘤形成和類(lèi)胚體形成實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證大鼠iPSCs的干性。(3)鑒定并繁育TTF-1小鼠，采集TTF-1+/-基因型小鼠雜交的囊胚。應(yīng)用顯微操作技術(shù)，將狀態(tài)較好和干性較強(qiáng)的大鼠iPSCs作為供體細(xì)胞進(jìn)行種間囊胚互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。(4)利用PCR對(duì)嵌合小鼠進(jìn)行基因型鑒定;通過(guò)H/E染色對(duì)嵌合鼠的肺進(jìn)行形態(tài)組織學(xué)觀測(cè);利用免疫組化檢測(cè)EGFP、TTF-1陽(yáng)性細(xì)胞在嵌合小鼠的肺及其它臟器中的分布;利用免疫組化檢測(cè)CCSP、SP-C和

3、Foxj1表達(dá)，觀測(cè)再生肺的發(fā)育和分化情況。
　　結(jié)果:(1)大鼠iPSCs堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽(yáng)性;RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光均檢測(cè)到干細(xì)胞多能性因子在大鼠iPSCs中的表達(dá);畸胎瘤形成和類(lèi)胚體形成實(shí)驗(yàn)等證明大鼠iPSCs具有三胚層分化的能力。(2)應(yīng)用顯微操作技術(shù)，成功進(jìn)行了三次囊胚注射實(shí)驗(yàn)，共注射191枚胚胎，小鼠出生44只，44只出生小鼠中發(fā)生嵌合5只。(3)利用小鼠特異的TTF-1引物對(duì)獲得的5只嵌合小鼠進(jìn)行了基因型鑒定，

4、確定其中一只為T(mén)TF-1雙敲小鼠，H/E結(jié)果表明TTF-1雙敲小鼠有再生的肺組織;EGFP、TTF-1免疫組化結(jié)果表明TTF-1雙敲小鼠再生的肺組織來(lái)源于大鼠iPSCs; CCSP、SP-C和Foxj1免疫組化的結(jié)果表明再生的肺有克拉拉細(xì)胞、肺泡Ⅱ型細(xì)胞和終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的分化。
　　結(jié)論:應(yīng)用大鼠iPSCs結(jié)合囊胚互補(bǔ)技術(shù)成功在TTF-1敲除的肺發(fā)育缺陷的小鼠模型中再生出大鼠iPSCs來(lái)源的肺。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用誘導(dǎo)多功能干細(xì)