蛋白提取方法

1、蛋白提取淺談,合伙人：李富生、袁倩、賀位皇 2015-1-19,5,第一談：蛋白的個(gè)性第二談：捕獲蛋白的網(wǎng)第三談： 冷丙酮和苯酚提取的命脈第四談：蛋白提取哪加強(qiáng),蛋白提取,第一談：蛋白的個(gè)性,按蛋白物種類(lèi)別，蛋白可分為：1.植物蛋白（色素）2.動(dòng)物蛋白3.微生物蛋白（培養(yǎng)基洗脫）,4,根據(jù)蛋白的溶解性，蛋白可分為：1.可溶性蛋白質(zhì) ：可

2、溶性蛋白質(zhì)是指可溶于水、稀中性鹽和稀酸溶液。 可溶性蛋白約占總蛋白含量的80% 2.醇溶性蛋白質(zhì)： 一類(lèi)不溶于水而溶于70％～80%乙醇的蛋白質(zhì)。 3.不溶性蛋白質(zhì) ：此類(lèi)蛋白質(zhì)既不溶于水、稀鹽溶液，也不溶于一般有機(jī)溶劑,——針對(duì)溶解性如此調(diào)皮的蛋白，我們?cè)撚檬裁慈軇└谢?？——L3裂解液（尿素、SDS、Tris）,第二談：捕獲蛋白的網(wǎng)1

3、. 高濃度中性鹽沉淀法（鹽析）（不變性）,2. 有機(jī)溶劑沉淀法,,原理：脫水作用和降低介電常數(shù) 破壞了水化層 破壞了雙電層，增加帶電 質(zhì)點(diǎn)間的相互作用,,,,,,,,3. 等電點(diǎn)沉淀法原理：凈電荷為0，彼此失去了電荷排斥作用而趨于凝聚。4. 重金屬鹽沉淀法原理：當(dāng)溶液的PH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白

4、質(zhì)顆粒帶負(fù)電，這樣它就容易與重金屬離子結(jié)成不溶性鹽而沉淀。5. 有機(jī)酸沉淀法原理：當(dāng)溶液的PH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電，它就與生物堿試劑或酸類(lèi)發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。,有機(jī)溶劑沉淀法相比其他沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)1.分辨能力高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只有在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇最合適的溶劑可以使實(shí)驗(yàn)盡可能準(zhǔn)確。3.成本較低。缺點(diǎn)容易引起蛋白質(zhì)變性失活，操作常需在低溫下進(jìn)行

5、。且有機(jī)溶劑易燃、易爆、安全要求較高。,第三談：冷丙酮和苯酚提取的命脈,,丙酮沉淀蛋白的機(jī)理是： 根據(jù)庫(kù)倫定律，溶液介電常數(shù)的下降（丙酮25攝氏度時(shí)介電常數(shù)為21，水為81），造成靜電作用力的增強(qiáng)，同時(shí)，丙酮與蛋白對(duì)水的爭(zhēng)奪直接導(dǎo)致水化層的破壞，從而造成蛋白沉降。 丙酮造成蛋白變性的原因： 常溫或升溫時(shí)，蛋白立體結(jié)構(gòu)展開(kāi)，丙酮極容易與其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸進(jìn)行疏水結(jié)合導(dǎo)致蛋白變性，所以我們通常預(yù)

6、冷丙酮并且低溫操作。低濃度的鹽不會(huì)沉淀，但是通常鹽濃度高于0.1molL時(shí)，因?yàn)榻殡姵?shù)的降低導(dǎo)致鹽的溶解度也下降而析出。初始蛋白濃度不易過(guò)高，很容易造成共沉淀。,冷丙酮沉淀1.冷丙酮沉淀的時(shí)間與溫度。2.超聲功率和時(shí)間，重在觀察超聲后樣品溶性的均勻度。3.還原烷基化。苯酚提取1.各種試劑的正確及精確配置。（如：蔗糖提取液）2.加入飽和酚后的充分震蕩和離心。（使蛋白充分與酚、色素H鍵結(jié)合，讓其分三層）3.純化蛋白。（

7、甲醇、TCA/冷丙酮去色素、苯酚等雜質(zhì)）,實(shí)例：P140678野生番木瓜蛋白提取,,第四談：蛋白提取哪加強(qiáng),1.冷丙酮沉淀時(shí)間。 在蛋白提取操作流程中，最為耗時(shí)的屬于冷丙酮沉淀這一步，一般沉淀2h甚至過(guò)夜。 在提取質(zhì)量保證的前提下，如何壓縮冷丙酮沉淀的時(shí)間，或者找到一個(gè)最適宜的時(shí)間，這是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。因?yàn)闀r(shí)間的大大縮短，不僅可以提高效率，而且可以提高產(chǎn)率。,以大麥麥粒為研究對(duì)象（植物雜質(zhì)多，蛋白提取率 低）

8、采用單一變量原則，只控制冷丙酮沉淀時(shí)間的不同，設(shè)時(shí)間為t，取四個(gè)有代表性的時(shí)間點(diǎn)：10、30、60、120（單位：min）使用TCA/冷丙酮沉淀蛋白流程，最后得膠圖：,由膠圖可以看出，各時(shí)間段膠圖條帶相似，無(wú)明顯差別，可見(jiàn)，沉淀蛋白時(shí)間的長(zhǎng)短，對(duì)蛋白含量分布，沒(méi)有什么重大影響。 由定量數(shù)據(jù)可知，冷丙酮沉淀大麥的時(shí)間為10min時(shí)，蛋白濃度最高，且可以推出隨著沉淀時(shí)間的增長(zhǎng)，蛋白的終濃度有所下降。 許多研