麥清蛋白的初步提取

1、實驗四預習報告：實驗四預習報告：麥清蛋白的初步提取麥清蛋白的初步提取1.1.研究背景研究背景生物大分子的分離純化是科學研究和商業(yè)化開發(fā)所需要的。而對某一特定目標物的制備是基于其自身獨特的性質(zhì)。但隨著純度要求的提高，同一類物質(zhì)之間的性質(zhì)的相似使進一步的精分離難度也隨之提高。理論研究對物質(zhì)濃度的要求，在原有技術難以達到的情況下，必然催生新的技術以提高純化水平。由此產(chǎn)生了許多的分離純化技術。在所有的分離純化技術中，層析技術以其獨特的優(yōu)勢始終占

2、據(jù)著生物大分子純化的主導地位。層析法是利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以固定相對流動相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。根據(jù)物質(zhì)的分離機制，又可以分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等類別。層析法具有明顯的優(yōu)勢：（1）從理論上來講，只要遷移距離足夠長，任何物質(zhì)都可以從其所在的混合體系中被分離出來；（2）除了定性能力較差以外，層析法幾乎囊括了物質(zhì)分析純化中的所有優(yōu)

3、點，比如分離效率高、速度快，樣品用量少、檢測靈敏度高、分析速度快、易于自動化管理等；（3）基于不同的原理，層析法衍生出諸多的操作技術，在實際應用中可以根據(jù)待分離物質(zhì)的特定性質(zhì)選擇適合的操作技術?；谝陨显颍瑢游龇ㄔ诜治龌瘜W、有機化學、生物化學等領域有著非常廣泛的應用，在分離高純度、高活性的生物大分子中有著不可替代的作用。2.2.研究目標研究目標以凝膠過濾層析法完成麥清蛋白的脫鹽以驗證該技術的可行性；掌握柱層析技術的基本操作技巧；體會相

4、關技術的發(fā)明思路和歷程，領悟新技術的發(fā)明對邊緣性實驗學科的重要作用。3.3.研究策略研究策略本實驗選取廣泛用于生物大分子純化的分子篩層析技術完成麥清蛋白的除鹽從而來研究層析技術。通過鹽析法對小麥種子提取液做初步的提純，得到麥清蛋白與硫酸銨的混合物，然后通過凝膠過濾層析除鹽，最后利用紫外分光光度法測定各階段純化產(chǎn)物的OD280以檢測蛋白含量，同時用BaCl2檢測純化產(chǎn)物中有無硫酸根離子從而鑒定純化效果。稱取適量葡聚糖凝膠G25→加入足量蒸

5、餾水或洗脫液→沸水浴溶脹5h→攪拌使其懸浮→靜置，使大部分凝膠沉降→用傾斜法除去含細碎顆粒的上層液→反復多次，直至無細顆粒為止→將凝膠在真空干燥器中減壓除氣，準備裝柱（2）裝柱層析柱下端止水→裝入約14柱長的洗脫液→倒入凝膠，開啟洗脫→裝柱至34左右，注意使柱中凝膠一直處在溶液中（注：裝柱完成后層析柱下端需適時止水以保證洗脫液面高于凝膠頁面3～5cm，以防凝膠因脫水而毀柱）→凝膠沉降完成，旋上柱帽并連接洗脫系統(tǒng)，平衡洗脫3h（注：裝柱時

6、應保證層析柱的均一性，否則會嚴重影響分離的結果。合格的凝膠柱應該上下均一，無界面、氣泡和裂隙）→連接恒流泵和收集檢測系統(tǒng)，調(diào)節(jié)好流速和收集系統(tǒng)以備下用（控制流速為每滴10秒，收集量為每管3毫升）（3）鹽析法分離提取麥清蛋白粉碎2g小麥種子→置于三角瓶中，加20ml蒸餾水→連續(xù)震蕩0.5h，再間歇震蕩0.5h→3000rmin離心20min，取上清液（澄清透明，否則再過濾）→用醋酸調(diào)pH至4.7→邊攪拌邊加入等體積的飽和硫酸銨溶液，有白色

7、絮狀沉淀產(chǎn)生，冰箱冷藏室過夜（充分沉淀麥清蛋白）→3000rmin離心20min，棄上清液，加2ml去離子水充分溶解沉淀，得混合液，準備上樣脫鹽。（4）上樣在柱內(nèi)放入濾紙片，自然飄落覆蓋（防止上樣時不溶物侵入柱床和液滴對床面的沖擊）→用恒流泵加速按鈕使洗脫液面和膠床表面相齊，停止洗脫→將1ml樣品提取液注入凝膠床面中央，開啟洗脫和收集器收集→待樣液與凝膠床面相齊時用滴管加入略高于剛才上樣高度的洗脫液，重復兩次，（將殘留在壁上的樣品洗入膠