分析化學(xué)-色譜聯(lián)用分析法

1、第二十一章 色譜聯(lián)用分析法,色譜-質(zhì)譜、波譜聯(lián)用分析法,將分離能力很強(qiáng)的色譜儀與定性、定結(jié)構(gòu)能力很強(qiáng)的質(zhì)譜或光譜儀器通過(guò)適當(dāng)?shù)慕涌?interface)相結(jié)合成完整的分析儀器，借助計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行物質(zhì)分析的方法。,第一節(jié) 色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析法,主要包括氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用 GC-MS高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用 HPLC-MS毛細(xì)管電泳－質(zhì)譜聯(lián)用 CE-MS,一、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用,（一）原理 由于GC的試樣呈氣態(tài)，流

2、動(dòng)相也是氣體，與質(zhì)譜儀的進(jìn)樣要求相匹配，故最容易將這兩種儀器聯(lián)用。,（二）氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀器,主要由色譜單元、質(zhì)譜單元和接口三大部分組成,接口裝置的作用 將色譜與質(zhì)譜聯(lián)接起來(lái)，以除去載氣、 降低氣相色譜儀柱后流出物的氣壓，同時(shí)對(duì)試樣起富集的作用，并把組分送到質(zhì)譜儀的離子源。,1．接口(interface) 實(shí)現(xiàn)聯(lián)用的關(guān)鍵,GC-MS對(duì)接口的一般要求是：①能使色譜分離后的各組分盡可能多地進(jìn)入質(zhì)譜儀，并使載氣

3、盡可能少地進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)。②維持離子源的高真空。③組分在通過(guò)接口時(shí)應(yīng)不發(fā)生化學(xué)變化。④接口對(duì)試樣的有效傳遞應(yīng)具有良好的重現(xiàn)性。⑤接口的控制操作應(yīng)簡(jiǎn)單、方便、可靠。⑥接口應(yīng)盡可能的短,以使試樣盡可能快速通過(guò)接口。,GC-MS的接口有直接導(dǎo)入型和濃縮型,直接導(dǎo)入型,裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易維護(hù)，但它無(wú)濃縮作用,噴射式濃縮型接口,具備去除載氣、濃縮樣品的功能，即具有分子分離的能力,2．質(zhì)譜單元,GC-MS中的質(zhì)譜應(yīng)滿足下列要求：真空系統(tǒng)不

4、受載氣流量的影響靈敏度和分辨率與色譜系統(tǒng)匹配掃描速度與色譜流出速度相適應(yīng),（1）離子源,電子轟擊源（EI）是GC-MS中最常用的離子源,優(yōu)點(diǎn)：①譜圖重現(xiàn)性好 ②有較多的碎片離子，提供豐富的結(jié)構(gòu)信息③靈敏度高,化學(xué)電離源（CI）也是GC-MS配置的離子源之一,（2）質(zhì)量分析器,四極質(zhì)量分析器掃描速度快，并可從正離子到負(fù)離子檢測(cè)自動(dòng)切換，而且靈巧輕便，價(jià)格便宜，是GC-MS中最流行的質(zhì)量分析器。離子阱質(zhì)量分析器飛行時(shí)

5、間質(zhì)量分析器,3．色譜單元 用于GC-MS色譜系統(tǒng)應(yīng)該符合質(zhì)譜儀的一些特殊要求。主要是： ①固定相應(yīng)選擇耐高溫，不易流失的固定液，最好用鍵合相。 ②載氣應(yīng)不干擾質(zhì)譜檢測(cè)，一般常用氦氣。,（三）氣相色譜－質(zhì)譜分析的應(yīng)用,GC-MS聯(lián)用分析的靈敏度高，適合于低分子化合物(相對(duì)分子質(zhì)量＜1000）的分析，尤其適合于揮發(fā)性成分的分析。在藥物的生產(chǎn)、質(zhì)量控制和研究中在中藥揮發(fā)性成分的鑒定食品和中藥中農(nóng)藥殘留量的測(cè)定體育競(jìng)賽中

6、興奮劑等違禁藥品的檢測(cè)環(huán)境監(jiān)測(cè),二、高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用,（一）原理 以高效液相色譜為分離手段，以質(zhì)譜為鑒定和測(cè)定手段，通過(guò)適當(dāng)接口(interface)將二者聯(lián)接成完整儀器。,（二）高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀器,1．高效液相色譜－質(zhì)譜接口和離子化,接口裝置必須既能滿足液、質(zhì)兩譜在線聯(lián)用的真空匹配要求，又能實(shí)現(xiàn)被分析組分的離子化。,離子化方式有兩種：試樣在離子源中以氣體形式被離子化是從固體表面或溶液中濺射出帶電離子,大氣壓離子

7、化--最常用電噴霧離子化（ESI）大氣壓化學(xué)離子化 (APCI)大氣壓光離子化 (APPI),（1）電噴霧離子化接口,電噴霧離子化是將溶液中試樣離子轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子的一種接口,電噴霧接口示意圖,電噴霧離子化過(guò)程示意圖,HPLC-ESI-MS譜圖主要給出準(zhǔn)分子離子的相關(guān)信息，例如在單電荷情況下的[M+H]+、[M+Na]+、[M－H]?等，對(duì)于生物大分子如蛋白質(zhì)、肽等，還能產(chǎn)生大量的多電荷離子。ESI常用于強(qiáng)極性、熱不穩(wěn)定化合

8、物及高分子化合物的測(cè)定。ESI的主要缺點(diǎn)是只能允許非常小的流動(dòng)相流量。,（2）大氣壓化學(xué)離子化接口,大氣壓化學(xué)離子化接口將溶液中組分的分子轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子的一種接口,APCI適用分析有一定揮發(fā)性的中等極性與弱極性，相對(duì)分子質(zhì)量在2000以下的小分子化合物。最大優(yōu)點(diǎn)是使HPLC與MS有很高的匹配度,允許使用流速高及含水量高的流動(dòng)相，極易與RP-HPLC條件匹配。與ESI相比，APCI對(duì)流動(dòng)相種類、流速及添加物的依賴性較小。,（2）質(zhì)量

9、分析器,四極質(zhì)量分析器離子阱質(zhì)量分析器飛行時(shí)間質(zhì)量分析器,串聯(lián)四極質(zhì)量分析器--使用較廣泛,將三個(gè)四極質(zhì)量分析器串聯(lián)起來(lái)使用,第一個(gè)四極質(zhì)量分析器進(jìn)行質(zhì)量分離第二個(gè)四極質(zhì)量分析器--碰撞池，產(chǎn)生產(chǎn)物離子產(chǎn)物離子由第三個(gè)四極質(zhì)量分析器分離分析,串聯(lián)四極質(zhì)量分析器能夠進(jìn)行選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)，選擇性更高，使用串聯(lián)四極質(zhì)量分析器的質(zhì)譜稱為串聯(lián)質(zhì)譜。,3．色譜單元HPLC-MS中的色譜柱一般短柱，以縮短分析時(shí)間，最常用的固定相為ODS。

10、HPLC-MS對(duì)流動(dòng)相的基本要求是不含非揮發(fā)性鹽類，以防其析出堵塞毛細(xì)管等。所用溶劑的純度最好都是色譜純。流動(dòng)相中揮發(fā)性電解質(zhì)如甲酸、乙酸、氨水、乙酸銨等的濃度也不能太高。流動(dòng)相的pH、流速均對(duì)檢測(cè)靈敏度有很大影響。,（三）高效液相色譜－質(zhì)譜分析的特點(diǎn)和應(yīng)用,1．高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的特點(diǎn) ①適用的范圍寬。 ②提供各種信息。可產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子和多級(jí)質(zhì)譜可提供豐富的結(jié)構(gòu)信息。

11、 ③有很高的靈敏度和樣品通量。 可在色譜分離不完全的情況下對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的痕量組分進(jìn)行快速定性和定量分析。,2．高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的應(yīng)用和分析條件 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、食品化工等許多領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。,HPLC-MS分析實(shí)驗(yàn)條件的選擇： （1）流動(dòng)相和流量：常用流動(dòng)相為水、甲醇、乙腈及它們的混合物，可用醋酸、甲酸或它們的銨鹽溶液調(diào)節(jié)pH ，應(yīng)避免磷酸

12、鹽或離子對(duì)試劑等。流量對(duì)LC-MS分析有較大影響。 （2）離子檢測(cè)模式：堿性物質(zhì)選擇正離子檢測(cè)模式，可用醋酸或甲酸使試樣酸化至pKa－2。酸性物質(zhì)及含有較多強(qiáng)電負(fù)性基團(tuán)的物質(zhì)，選擇負(fù)離子檢測(cè)模式。 （3）溫度：接口的干燥氣體溫度應(yīng)高于待分析物沸點(diǎn)20℃左右，同時(shí)要考慮物質(zhì)的熱穩(wěn)定性和流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例。,三、毛細(xì)管電泳－質(zhì)譜聯(lián)用,CE的高效分離能力與MS鑒定結(jié)構(gòu)能力的有機(jī)結(jié)合,若實(shí)現(xiàn)毛細(xì)管電泳-ESI-質(zhì)譜聯(lián)用，須解決的問(wèn)題：

13、①電壓匹配問(wèn)題。 ②CE是依賴電滲作為流體的動(dòng)力，若與質(zhì)譜聯(lián)接時(shí)，質(zhì)譜的高真空與CE造成的真空差，將會(huì)引起CE的電滲流的擾動(dòng)，破壞分離。 ③CE的進(jìn)樣量小，要求MS要有很高的靈敏度。④CE分離工作大都是使用磷酸鹽緩沖溶液來(lái)完成，與MS聯(lián)用時(shí)，只能用易揮發(fā)鹽的緩沖鹽溶液。,四、色譜－質(zhì)譜的掃描模式及 其提供的

14、信息,色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析掃描模式全掃描（full scanning）選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM),（一）全掃描 全掃描是質(zhì)量分析器在給定的時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)給定質(zhì)荷比范圍進(jìn)行無(wú)間斷地掃描，獲得樣品中每一個(gè)組分（或在某一特定時(shí)刻）的全部質(zhì)譜。在這種掃描模式下，可以獲得各種定性和定量信息。,1．色譜－質(zhì)譜三維譜,X坐標(biāo)表示質(zhì)荷比m/z，Y坐標(biāo)表示時(shí)間或連續(xù)掃描的次數(shù)，Z坐標(biāo)表示離子流的強(qiáng)度(離子豐度)。,2.質(zhì)譜

15、 將全掃描得到的分子離子 或準(zhǔn)分子 離子（[M+H]+、[M－H]?、[M+Na]+等）及所有碎片離子的質(zhì)荷比與其對(duì)應(yīng)的離子流的相對(duì)強(qiáng)度作圖,給出總離子流色譜圖上每一個(gè)色譜峰的質(zhì)譜,3.總離子流色譜圖（TIC）是總離子流強(qiáng)度隨時(shí)間（掃描次數(shù)）變化的色譜圖,其中對(duì)應(yīng)某一時(shí)間點(diǎn)的峰高是該時(shí)間點(diǎn)流進(jìn)的組分的所有質(zhì)荷比的離子強(qiáng)度的加和。,給出保留值、峰高和峰面積,4.質(zhì)量色譜圖 是從計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)的總離子流色譜圖的數(shù)據(jù)中，按質(zhì)荷比調(diào)出的色譜圖

16、。 質(zhì)量色譜可以鑒別某化合物或具有某基團(tuán)的一組化合物的存在。 即使沒(méi)有實(shí)現(xiàn)色譜完全分離的峰也可進(jìn)行定量。,（二）選擇離子監(jiān)測(cè)選擇離子監(jiān)測(cè)是對(duì)一個(gè)或一組特定離子進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。只檢測(cè)一個(gè)質(zhì)量的離子稱為單離子監(jiān)測(cè)(SIM)檢測(cè)多離子的稱為多離子檢測(cè)(MID)選

17、擇離子監(jiān)測(cè)可以把全掃描模式所得的復(fù)雜的總離子色譜圖變得非常簡(jiǎn)單，即獲得的質(zhì)量色譜圖。提高了靈敏度，同時(shí)有更快的掃描速度。選擇離子監(jiān)測(cè)主要用于定量分析。,（三）選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)是串聯(lián)質(zhì)譜的一種檢測(cè)模式，即監(jiān)測(cè)一個(gè)或幾個(gè)特定的離子反應(yīng)，監(jiān)測(cè)幾個(gè)離子反應(yīng)又稱為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。,選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)能對(duì)復(fù)雜混合物中的痕量組分進(jìn)行快速鑒別和定量分析，選擇性高，靈敏度高。,此外，產(chǎn)物離子掃描、前體離子掃描和中性丟失掃描三種模式也是串聯(lián)質(zhì)譜

18、的檢測(cè)模式。,第二節(jié) 其他聯(lián)用分析法,一、氣相色譜－傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用,（一）氣相色譜－傅立葉變換紅外光 譜聯(lián)用儀器,由氣相色譜儀、接口、傅立葉變換紅外光譜儀及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)四部分組成。,在相應(yīng)軟件控制下，儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)傅立葉變換，在顯示器上實(shí)時(shí)顯示GC餾分的氣態(tài)IR譜圖其x軸為波數(shù)，y軸為吸光度，z軸為時(shí)間,（二）氣相色譜－傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用獲得的譜圖,1.實(shí)時(shí)三維譜圖,2.重建色譜圖,在相應(yīng)軟件控制下，儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)傅立葉變換，

19、在顯示器上實(shí)時(shí)顯示GC餾分的氣態(tài)IR譜圖，其x軸為波數(shù)，y軸為吸光度，z軸為時(shí)間,由紅外檢測(cè)器記錄的干涉圖經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后得到的色譜圖,3．紅外光譜圖,（1）化學(xué)圖,（2）Gram-Schmidt重建色譜圖,（3）紅外總吸收度重建色譜圖,重建色譜圖包括：,,二、高效液相色譜－核磁共振波譜聯(lián)用,核磁共振波譜是測(cè)定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的最強(qiáng)有力的技術(shù)之一,但是實(shí)現(xiàn)這種聯(lián)用又是最具有挑戰(zhàn)性的一門技術(shù),①HPLC流動(dòng)相中的質(zhì)子嚴(yán)重干擾組分的1H-NMR

20、譜②梯度洗脫時(shí)，溶劑的濃度不斷變化，δ值也不 斷變化③核磁共振波譜的靈敏度較低④NMR難于與HPLC在線聯(lián)用,HPLC-NMR能夠獲得復(fù)雜試樣中微量組分的定性信息及二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，能測(cè)定這些組分的氫譜、碳譜及各種相關(guān)譜，必將成為復(fù)雜試樣如中藥的活性成分、生物樣品中的藥物及其代謝物等微量組分的定性分析和結(jié)構(gòu)鑒定的最重要手段，目前已經(jīng)出現(xiàn)了LC-NMR-MS聯(lián)用技術(shù)用于代謝組學(xué)研究。,色譜－色譜聯(lián)用是由多種不同類型的色譜組合而成的聯(lián)用

21、系統(tǒng)，又稱為多維色譜，其主要作用是提高色譜分辨能力和增加峰容量。 由同類流動(dòng)相、相同分離機(jī)制但不同選擇性色譜柱串聯(lián)組成，例如GC-GC、HPLC-HPLC及SFC-SFC等。 由不同類流動(dòng)相、不同分離機(jī)制及不同選擇性色譜柱組成，例如HPLC-GC、H

22、PLC-SFC、SFC-GC、HPLC-CE及GC-TLC、SFC-TLC、HPLC-TLC等。,三、色譜－色譜聯(lián)用,全二維氣相色譜（C2D-GC）是將分離機(jī)制不同而又相互獨(dú)立的兩根色譜柱串聯(lián)起來(lái)，經(jīng)柱1分離后的每一個(gè)流分都經(jīng)過(guò)接口進(jìn)行聚焦，然后以脈沖方式依次進(jìn)入柱2進(jìn)行第二次分離，組分從柱2流出后進(jìn)入檢測(cè)器，信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)處理后，得到以柱1保留時(shí)間為縱坐標(biāo)，柱2保留時(shí)間為橫坐標(biāo)的二維色譜圖。,（一）全二維氣相色譜,1.全二維氣相色譜

23、儀器,（1）接口（2）色譜柱（3）檢測(cè)器,2．全二維氣相色譜的特點(diǎn)和應(yīng)用,特點(diǎn)：①峰容量大。②分析速度快③靈敏度高④定性定量準(zhǔn)確⑤分辨率高,（二）高效液相色譜－高效液相色譜聯(lián)用,關(guān)鍵技術(shù)是柱切換,有更強(qiáng)的分離能力,（三）薄層色譜有關(guān)的聯(lián)用,思考題和習(xí)題1．簡(jiǎn)述GC-MS和HPLC-MS的原理。2．分別簡(jiǎn)述電噴霧和大氣壓化學(xué)離子化接口的原 理和特點(diǎn)。3．色譜－質(zhì)譜聯(lián)用全掃描模式可獲得哪些信息？4．什么