蜂膠渣抑制桑青枯菌成分咖啡酸酯類化合物的酶促合成與生物活性.pdf

1、桑樹青枯病是由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡稱青枯菌）引起的一種植物細菌病，具有發(fā)病急、蔓延迅速、危害嚴重、防治困難等特點，屬于對蠶業(yè)生產(chǎn)毀滅性危害的重要桑樹病害之一。當前，桑青枯病的防治措施使用的藥劑多為化學農(nóng)藥，毒性較大，污染環(huán)境，有的已經(jīng)禁用，因此急需尋找毒性較小、環(huán)境友好和成本可控的新型生物農(nóng)藥制劑。自古以來，蜂膠的抗菌效果得到公認，是蜂巢防病治蟲這一天然防御系統(tǒng)的重要組成部分。目前，市場上的蜂膠

2、保健食品常以總黃酮含量作為產(chǎn)品質(zhì)量評價標準，因而蜂膠制品的工業(yè)化生產(chǎn)主要是提取其黃酮類成分，而具有抗菌活性的咖啡酸及其酯類衍生物則殘留在大量的蜂膠渣中，若加以利用開發(fā)天然來源的農(nóng)藥制劑，則會變廢為寶，既節(jié)約了成本，又保護了環(huán)境，符合國家實施綠色植保戰(zhàn)略要求，具有重要的學術意義和經(jīng)濟價值。因此，本課題擬從蜂膠渣中篩選出抑制青枯菌活性強的咖啡酸酯類單體，構(gòu)建新型雙液相酶促合成新工藝，比較分析敏感差異的病原菌全基因組，并探究對桑葉重要害蟲及天

3、敵的影響。主要研究內(nèi)容及結(jié)論如下：
　　（1）為尋找蜂膠渣中所含的抑菌活性成分，基于活性追蹤法，評價蜂膠渣按照溶劑極性制備的分級提取物對青枯菌五個生理小種的抑制效果，采用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術對其含有的咖啡酸及其酯類化合物作定性定量分析，并結(jié)合藥效進一步篩選出高活性單體化合物。結(jié)果表明，蜂膠渣的甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯以及石油醚等提取物對青枯菌的五個小種均有一定的抑菌活性，其中乙醇提取物活性高于其他。0.1 mg/mL的除蠟

4、蜂膠渣乙醇提取物對桑樹青枯病病原菌RS-5的抑菌率達91.61±4.75％。對蜂膠渣乙醇提取物應用ESI-LC-MS技術，采用全掃描模式鑒別了咖啡酸及5種咖啡酸酯類化合物，采用選擇性反應監(jiān)測（Selective Reaction Monitor, SRM）模式基于特征離子對測定了咖啡酸和咖啡酸苯乙酯的含量。從咖啡酸及其6種酯類單體化合物中篩出MC（Methyl caffeate, MC）和咖啡酸苯乙酯（Caffeic acid phen

5、ethyl ester, CAPE）兩種單體，EC50值分別為310.0-1225.0μg/mL和165.2-752.7μg/mL，對病原菌的細胞產(chǎn)生了變形、破損等嚴重傷害，對其泳動性和形成生物膜等病原傳播特性造成了極大控制，是潛在的桑青枯菌抑制劑，為研發(fā)天然來源的桑樹青枯病防控藥劑提供了新的思路。
　　（2）為提高底物溶解度和合成效率，應用雙相催化的原理，通過添加氧膦類絡合劑營造可逆的絡合萃取效應，首次構(gòu)建―TOPO-環(huán)己烷/[

6、Bmim][Tf2N]‖體系，以強化脂肪酶催化MC與2-苯乙醇發(fā)生酯交換合成抑菌活性單體CAPE，解析絡合萃取強化酶促反應分離耦合的過程機理，為高效生物合成咖啡酸酯類衍生物提供新工藝；為監(jiān)測連續(xù)流酶催化轉(zhuǎn)酯化合成過程中的底物MC和產(chǎn)物CAPE，實時表征連續(xù)流酶催化的反應動力學參數(shù)，采用新型離子源的實時直接分析質(zhì)譜技術（Direct Analysis in Real Time-Mass, DART-MS）建立了一種快速簡便的定量新方法。結(jié)

7、果表明，三正辛基氧膦（Trioctylphosphine oxide, TOPO）為絡合劑，對 MC和 CAPE等咖啡酸酯類單體具有高選擇性的可逆絡合反應特性，構(gòu)建的TOPO-環(huán)己烷/[Bmim][Tf2N](1:1, v/v)雙相體系適用于Novozym435催化酯交換反應合成 CAPE。通過響應曲面分析法獲得最優(yōu)工藝條件，即在25 g/L TOPO-環(huán)己烷/[Bmim][Tf2N](1:1, v/v)中，MC濃度為10 g/L、2-

8、苯乙醇與MC的摩爾比為20:1、反應溫度為76℃、TOPO濃度為25 g/L、時間為59 h時，MC的轉(zhuǎn)化率為98.83±0.76%，CAPE的得率為96.29±0.07%。其中，最適底物濃度提高了3.33倍；單位底物的催化劑用量減少了77.8%，降低了工藝成本。通過化學計量計算、紅外光譜和酶動力學分析，證實TOPO和咖啡酸酯類單體之間的可逆性氫鍵締合效應顯著增強了反應分離耦合對脂肪酶催化反應的協(xié)同作用。選擇負離子模式，通過優(yōu)化 DAR

9、T離子源的操作參數(shù)提高了檢測靈敏度，獲得了高質(zhì)量的質(zhì)譜，成功建立了生物催化體系中咖啡酸酯類組分的DART-MS檢測新方法，反應物直接檢測，無需純化。使用DART-MS2測定由MC（母離子m/z192.87和子離子m/z133.44）和CAPE（母離子m/z282.93和子離子m/z178.87）產(chǎn)生的特定離子，根據(jù)SRM信號的峰面積，外標法計算標準曲線。在3.125~50 mg/L范圍內(nèi)獲得MC和CAPE的線性回歸方程，相關系數(shù)（R2）

10、分別為0.9515和0.9973，檢測限分別為0.005 mg/L和0.003 mg/L，定量限分別為0.02和0.01 mg/L，回收率范圍分別為92.50-97.11%和90.11-97.60%。使用DART-MS分析每個樣品約40秒，結(jié)果與常規(guī)高效液相色譜法一致，成功用于測定連續(xù)流填充床微反應器中酶反應動力學常數(shù)和質(zhì)量傳遞系數(shù)。因此，雙相體系為強化酶促合成CAPE提供了新介質(zhì)，DART-MS為微流控生物催化動力學表征提供了新手段。

11、
　?。?）為揭示青枯菌2個生理小種（GIM1.71和RS-5）對MC和CAPE的敏感性差異，利用比較基因組學的方法分析兩個小種間基因組結(jié)構(gòu)的差異，尋找可能導致耐藥性變化的特有基因，或序列結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的共有基因。采用目前最新的第三代測序技術，對GIM1.71和RS-5進行了全基因組測序，分別獲得約3.8M的全基因組序列以及所包含的質(zhì)粒序列。通過生物信息學方法對基因組中的編碼基因、重復序列和非編碼 RNA進行了全面的注釋，共得到約5

12、200編碼基因和約70個非編碼RNA（包括sRNA和tRNA）。通過與Gene Ontology數(shù)據(jù)庫的比對，對編碼基因的功能進行了注釋。通過 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋，對編碼基因參與的生物學通路進行了分析。通過對GIM1.71、RS-5和已報道GMI1000三個小種的比較，除三者共有的3833個基因外，共找到390個GIM1.71特有的基因和76個RS-5與GMI1000共有而GIM1.71缺失的基因。通過SNP、插入-缺失和基因組結(jié)構(gòu)變異

13、分析，在GIM1.71和RS-5基因組中，識別到了33,697個和44,368個SNP位點；對于三個小種共有基因，識別到了106個基因僅在GIM1.71小種中發(fā)生了小片段插入-缺失。這些發(fā)現(xiàn)將有助于揭示GIM1.71和RS-5之間對咖啡酸酯類單體敏感性的差異，為進一步的深入分析提供了候選目標。
　　（4）為探究MC對桑葉重要害蟲的抑制作用及天敵營養(yǎng)級的影響，評價其作為桑葉害蟲新型害蟲抑制劑的開發(fā)潛能，測定了MC對斜紋夜蛾、桑螟和斑

14、痣懸繭蜂適合度指標的影響。結(jié)果表明，1.0%和2.0%的MC對斜紋夜蛾和桑螟幼蟲均具有顯著的拒食作用，且斜紋夜蛾2齡幼蟲對1.0%和0.1%的MC溶液均存在取食選擇性。連續(xù)飼喂含2.0% MC的桑葉后，斜紋夜蛾幼蟲體重增長顯著放緩，而取食含1.0%和2.0%的MC的桑葉7 d后，桑螟體重僅為對照組的37.67%和30.00%。隨著MC濃度的升高，斜紋夜蛾和桑螟幼蟲的存活時間均顯著縮短，取食2.0%MC溶液后，兩者存活時間分別比對照組縮短

15、了24.6%和57.38%。MC對斜紋夜蛾幼蟲化蛹率無顯著影響，但在1.0%和2.0%濃度下斜紋夜蛾羽化率顯著下降；取食1.0%和2.0%的MC后，桑螟化蛹率分別比對照組下降了60.94%和53.25%，羽化率也隨之下降。斑痣懸繭蜂寄生取食不同濃度MC的斜紋夜蛾后，子代壽命、子代體型大小等重要的適合度指標均無顯著變化，僅在2.0%濃度處理下出繭數(shù)下降、子代蜂發(fā)育時間延長。因此，MC在三層營養(yǎng)級關系中，對害蟲的抑制作用較大，對寄生性天敵的