畢赤酵母常用培養(yǎng)基與載體

1、畢赤酵母常用培養(yǎng)基與載體畢赤酵母常用培養(yǎng)基與載體一、畢赤酵母表達(dá)常用載體：一、畢赤酵母表達(dá)常用載體：典型的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體載體包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子（5AOX1和3AOX1），它們被多克隆位點(diǎn)（MCS）分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標(biāo)記及3AOX1區(qū)。當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體時(shí)，它的5AOX1和3AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個(gè)載體連同外源基因插入到

2、受體染色體上，外源基因在5AOX1啟動(dòng)子控制下表達(dá)。畢赤酵母本身不分泌內(nèi)源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導(dǎo)分泌的信號(hào)序列。而由89個(gè)氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號(hào)—α交配因子(αfact)引導(dǎo)序列已經(jīng)成功地引導(dǎo)了幾種外源蛋白的分泌。分泌表達(dá)載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHILS1，pPICZαA，pYAM75P等。胞內(nèi)表達(dá)載體主要有：pHILD2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa

3、(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115（AOX1），KM71，SMD1168。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點(diǎn)彼ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。多拷貝表達(dá)菌株的獲得方式：與自主復(fù)制的質(zhì)粒型表

4、達(dá)載體不同，整合型表達(dá)載體的拷貝數(shù)可以有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達(dá)菌株合成蛋白的量也較多。體內(nèi)整合可通過(guò)高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過(guò)連接產(chǎn)生外源基因的串聯(lián)插入。多拷貝表達(dá)菌株的獲得方式有兩種：一種是利用SDSPAGE電泳、免疫雜交或菌落點(diǎn)雜交方法在大量的轉(zhuǎn)化子中進(jìn)行自然篩選。得到產(chǎn)量高的表達(dá)菌株。另一種在轉(zhuǎn)化前將多個(gè)表達(dá)盒拷貝插入到單個(gè)載體中，而后再通過(guò)交換整合到受體染色體上。表達(dá)蛋白純化方法：酵母系統(tǒng)

5、表達(dá)的蛋白一般都具有活性，所以都采用較溫和的純化方式來(lái)純化目的蛋白，分泌型表達(dá)的蛋白有利于純化，可用硫酸銨沉淀，然后用離子交換，凝膠過(guò)濾層析，疏水層析等方法進(jìn)一步純化。具體的方法和操作應(yīng)按所處理的目的蛋白的性質(zhì)選擇。二畢赤酵母表達(dá)的培養(yǎng)基配制和用途二畢赤酵母表達(dá)的培養(yǎng)基配制和用途2.1LB（Luria－Bertani）培養(yǎng)基：）培養(yǎng)基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCll％PH7.0制作平板時(shí)加入2％瓊脂粉。12

6、1℃高壓滅菌20min?？捎谑覝乇４?。用于培養(yǎng)pPICZαA原核宿主菌TOP10F’時(shí)可加入Zeocin25ugml。2.2LLB（LowSaltLB）培養(yǎng)基：）培養(yǎng)基：Tryptonl％畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基，YNB和Biotion過(guò)濾除菌。搖瓶培養(yǎng)時(shí)每24小時(shí)之后加入3%的甲醇誘導(dǎo)，一般誘導(dǎo)72小時(shí)。2.6YPDSZeocin培養(yǎng)基（培養(yǎng)基（YeastExtractPeptoneDextroseMedium）：）：yeastextr

7、act1%peptone2%dextrose(glucose)2%sbitol1Magar2%Zeocin100gml不管是液體YPDS培養(yǎng)基，還是YPDSZeocin培養(yǎng)基，都必須存放4℃條件下，有效期1～2周。2.7MGYMinimalGlycerolMedium（最小甘油培養(yǎng)基）（34%YNB；1%甘油；4105%生物素）。將800ml滅菌水、100ml的10YNB母液、2ml的500B母液和100ml的10GY母液混勻即可，4℃

8、保存，保存期為2個(gè)月。2.8MGYHMinimalGlycerolMediumHistidine（最小甘油培養(yǎng)基0.004%組氨酸）在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加入10ml的100H母液混勻，4℃保存，保存期為2個(gè)月。2.9RDRegenerationDextroseMedium（葡萄糖再生培養(yǎng)基）（含有：1molL的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4105%生物素；0.005%氨基酸）1.將186g的山梨醇定容至700ml，高

9、壓滅菌；2.冷卻后于45℃水浴；3.將100ml的10D、100ml的10YNB；2ml的500B；10ml的100AA等母液和88ml無(wú)菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4℃保存。2.10RDHRegenerationDextroseMediumHistidine（葡萄糖再生培養(yǎng)基0.004%組氨酸）在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入10ml的100H母液，同時(shí)無(wú)菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。