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1、實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室HIVHIV檢測(cè)技術(shù)概述及進(jìn)展檢測(cè)技術(shù)概述及進(jìn)展時(shí)間：200931116:57:31關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞】獲得性免疫缺陷綜合征HIV實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法艾滋病(AIDS)又稱(chēng)獲得性免疫缺陷綜合征，是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一種免疫缺陷性疾病［1］。HIV感染的診斷是艾滋病預(yù)防控制工作的重要組成部分，建立敏感實(shí)用的檢測(cè)方法對(duì)于監(jiān)測(cè)、診斷或血液篩查，控制艾滋病的流行顯得尤為重要。以下本文就HIV的檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展做一綜述。

2、1HIVHIV的感染機(jī)制及感染標(biāo)志的感染機(jī)制及感染標(biāo)志HIV病毒侵入人體后，其表面糖蛋白gp120與細(xì)胞表面受體蛋白CD4以高親和力結(jié)合，吸附到宿主細(xì)胞上；gp120再與宿主細(xì)胞表面輔助受體相互作用，使病毒與宿主細(xì)胞膜更接近；gp41產(chǎn)生一系列構(gòu)象變化，其N(xiāo)端的融合肽片段插入宿主細(xì)胞膜，導(dǎo)致病毒包膜與細(xì)胞膜的最終融合，病毒RNA進(jìn)入細(xì)胞。在HIV感染后，最先能夠監(jiān)測(cè)到病毒RNA、然后是p24抗原，最后是抗體［2］。在感染后的10～14d

3、內(nèi)，病毒RNA水平是呈指數(shù)上升，隨后下降并保持在持續(xù)穩(wěn)定的水平上，進(jìn)入HIV無(wú)癥狀期［3］。p24抗原水平隨著病毒RNA水平的發(fā)展而發(fā)展，在急性感染期就可以出現(xiàn)，被認(rèn)為是病毒復(fù)制的間接標(biāo)志，但由于檢測(cè)方法的靈敏度不夠而使得其檢出時(shí)間要比RNA晚。從HIV感染到能夠檢測(cè)出HIV抗體這一時(shí)期被稱(chēng)作“窗口期”。在窗口期，能夠通過(guò)病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴細(xì)胞水平來(lái)確定HIV感染。CD4淋巴細(xì)胞水平隨著感染的發(fā)展而逐漸下降當(dāng)其在血液中細(xì)

4、胞下降到200個(gè)mL時(shí)，就會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的免疫缺陷，患者就被確診為艾滋病。病毒RNA、p24抗原、HIV抗體和CD4淋巴細(xì)胞水平可以用來(lái)確定HIV感染、檢測(cè)病情發(fā)展［4］。HIV在病毒分類(lèi)中屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類(lèi)免疫缺陷病毒組。迄今為止，根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列測(cè)定，全球流行的HIV可分為2型：HIV1型和HIV2型［5］。在HIV1型內(nèi)，根據(jù)編碼包膜蛋白的env基因和編碼殼蛋白的gag基因序列的同源性又進(jìn)一步分為3個(gè)組：

5、Ｍ組（主要組）、Ｏ組（外圍組）和Ｎ組（新組或非M非O組），Ｍ組內(nèi)又可分為ＡＪ10個(gè)亞型。在HIV1型和HIV2型之間其核苷酸序列有45％的同源性，并且存在免疫交叉反應(yīng)。應(yīng)用免疫印跡法(Westblot)可以將二者明確地區(qū)別開(kāi)來(lái)［6］。2HIVHIV感染的主要檢測(cè)方法感染的主要檢測(cè)方法目前檢測(cè)HIV的方法有100多種［7］，總體來(lái)說(shuō)可以分為抗體檢測(cè)和病毒檢測(cè)兩大類(lèi)。病毒檢測(cè)包括細(xì)胞培養(yǎng)(病毒分離)、p24抗原檢測(cè)和病毒核酸檢測(cè)。早期

6、對(duì)HIV的診斷主要是通過(guò)血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)抗HIV的抗體間接地診斷HIV感染。近幾年，分子生物學(xué)方法不斷被應(yīng)用到HIV的檢測(cè)中，HIV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法取得了很大的進(jìn)展，核酸檢測(cè)已經(jīng)成為了HIV實(shí)驗(yàn)室診斷的發(fā)展方向［8］。抗體通常是在感染后3～8周能夠被檢測(cè)出來(lái)［9］。目前，大多應(yīng)用雙抗原夾心法，這種方法具有很好的靈敏性和特異性?？贵w檢測(cè)由初篩和確認(rèn)試驗(yàn)組成，初篩試驗(yàn)呈陽(yáng)性的必須進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的靈敏度，

7、且操作簡(jiǎn)單、快速，適合對(duì)大量樣品的檢測(cè)。因此，是目前臨床2.1.3免疫熒光試驗(yàn)(IFA)基本原理為應(yīng)用Ｈ9或HUT78培養(yǎng)細(xì)胞作為載體用HIV感染細(xì)胞該細(xì)胞內(nèi)就會(huì)含有HIV抗原將HIV感染的淋巴細(xì)胞涂于玻片上固定，制備為抗原片加入待檢血清，待檢血清中的抗HIV抗體與抗原結(jié)合后再與熒光素標(biāo)記的抗人Ig結(jié)合在熒光顯微鏡下可見(jiàn)到細(xì)胞內(nèi)有黃綠色熒光。2.1.4明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)PA的基本過(guò)程是先將樣品稀釋然后分別加入經(jīng)抗原致敏的和未致

8、敏的明膠顆?；靹蚝蟊?一般為室溫)。當(dāng)血清中有HIV抗體存在時(shí)經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA操作簡(jiǎn)便無(wú)需特殊儀器設(shè)備適合對(duì)少量標(biāo)本的檢測(cè)。2.1.5斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)(或免疫層析或滲濾)斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)一般采用硝酸纖維素膜作固相載體用HIV抗原包被于固相載體加入待測(cè)標(biāo)本(可為血清、血漿、尿液和其他體液)一定溫度反應(yīng)后洗去未結(jié)合于固相載體上的標(biāo)本包被抗原和被檢血清中抗體結(jié)合用膠體金(或膠體硒)

9、代替底物連接在葡萄球菌蛋白Ａ上金標(biāo)記蛋白Ａ具有與人Ig結(jié)合的能力因而可與被捕獲的HIV抗體結(jié)合。若樣品中有HIV抗體則薄膜上就會(huì)產(chǎn)生一桔紅色斑點(diǎn)(或線(xiàn)條)一般3～10min出結(jié)果特異性較好較為適宜于偏遠(yuǎn)地區(qū)臨床用血檢測(cè)但不適于城市地區(qū)的獻(xiàn)血員篩查。2.2分子生物學(xué)方法隨著生物技術(shù)的發(fā)展核酸檢測(cè)得到了人們?cè)絹?lái)越多的重視它可直接檢查HIVRNA可在發(fā)現(xiàn)血清學(xué)變化之前檢測(cè)HIV感染而且比Ｐ24抗原檢測(cè)方法更靈敏［16］。2.2.1多聚酶鏈反應(yīng)

10、檢測(cè)法PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。②模板DNA與引物的退火(復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。③引物的

11、延伸：DNA模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成1條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性—退火—延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成1個(gè)循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。檢測(cè)HIVRNA需要先利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增即