sod_測定方法

1、SOD氮藍(lán)四唑（NBT）法測定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基（O2）的酶。實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2，從而抑制

2、了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料；水稻或小麥葉片（二）儀器設(shè)備：1.高速臺(tái)式離心機(jī)；2.分光光度計(jì)；3.微量進(jìn)樣器；4.熒光燈（反應(yīng)試管處照度為4000Lx）；5.試管或指形管數(shù)支。（三）試劑1.0.05molL磷酸緩沖液（pH7.8）；2.130mmolL甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml

3、；3.750μmolL氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存；4.100μmolLEDTA－Na2溶液：稱取0.03721gEDTA－Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml；5.20μmolL核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.酶液提取取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，1ml預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使

4、終體積為5ml。取1.5～2ml于1000rpm下離心20min，上清液即為SOD粗提液。2.顯色反應(yīng)取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支為測定管，另2支為對照管，按下列加入各溶液：試劑（酶）用量（ml）終濃度（比色時(shí)）0.05molL磷酸緩沖液1.5130mmolLMet溶液0.313mmolL750μmolLNBT溶液0.375μmolL100μmolLEDTA－Na2液0.310μmolL20μmolL核黃素0.320μmol

5、L酶液0.052支對照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.25總體積3.0混勻后將1支對照管置暗處，其它各管于4000Lx日光下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高時(shí)間縮短，低時(shí)延長）。3.SOD活性測定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對照管做空白，分別測定其它各管的吸光度。四、結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50％為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。SOD總活性＝(Ack－AE)V(Ack0.5WVt)上式中，S

6、OD比活力＝SOD總活性蛋白質(zhì)含量式中SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以酶單位／mg蛋白表示Ack照光對照管的吸光度AE樣品管的吸光度V樣品液總體積（ml）Vt測定時(shí)樣品用量（ml）W樣鮮重（g）蛋白質(zhì)含量單位為：mg蛋白／g鮮重。式中:SOD總活性以UgFW比活力單位以Umg蛋白表示ACK為對照杯(光照)的光吸收值A(chǔ)E為樣品的光吸收值V為樣液總體積V1為測定時(shí)樣品用量W為樣重g.縮寫：SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化

7、氫酶；POD：過氧化物酶；MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷銅K30；LMet：甲硫氨酸；NBT：氮藍(lán)四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS:磷酸緩沖液SOD的測定方法加樣順序：（V=3ml）磷酸緩沖液：1.5mlLMet:0.3mlNBT:0.3mlEDTANa2:0.3ml核黃素：0.3ml酶液：0.05ml蒸餾水：0.25ml試劑配制：(1)0.05molLPBS：pH7.8(2)130mmolLLMet:1.93

8、99gMet用PBS定容至100ml(3)750mmolLNBT:0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4)100umolLEDTANa2:0.03721g用PBS定容至1000ml(5)20umolL核黃素:0.0753g用蒸餾水定容至1000ml(避光保存)注：（1）對照：以加緩沖液、不照光為空白；照光的為最大還原管(2)照光后至顯藍(lán)色要立即避光放置、迅速測定A560值SOD活性的測定方法[2005103112:51

9、:00|By:abingxu]0推薦pH7.8最適，按邵從本等（1993）方法。1.試劑：反應(yīng)液：含13103M甲硫氨酸（MW=149.21292），75106MNBT（MW=817.7），2106M核黃素（MW=376.36），100109MEDTA，50103M磷酸緩沖液，pH7.8。4.096225gNa2HPO4.12H2O，0.16576075gNaH2PO4.2H2O用蒸餾水溶解，加入0.484942g甲硫氨酸、0.0153

10、3gNBT、0.00075272g核黃素（擴(kuò)大10倍，溶于10ml蒸餾水，取0.25ml，此2種藥劑現(xiàn)用現(xiàn)加）及0.000037224gEDTANa2（配時(shí)擴(kuò)大100倍，用蒸餾水定容100ml后，取0.75ml），定容至250ml，4℃避光保存。2操作：取30支粗細(xì)、厚薄一致的潔凈試管，分別加入3.98反應(yīng)液，29支加20ul()酶液，另一支不加酶液加同樣體積的提取緩沖液，以1支加酶的不作光照處理的為空白對照，余4000Lux照光202