sod提取純化

1、1動物血中超氧化物歧化酶的提取與純化動物血中超氧化物歧化酶的提取與純化一、超氧化物歧化酶的提取超氧化物歧化酶的提取[原理原理]l969年，McCd和Fridovich第一次從牛血中提純到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布極廣，其含量隨生物體的不同而不同，即使同一種生物的不同組織或同一組織的不同部位，其SOD的種類和含量也有很大差別。迄今為止人們已從細菌，真菌、原生動物。藻類、昆蟲、魚類、植物和動物等各種生物體內(nèi)分離得到SOD。為拓寬提取

2、SOD的原料，篩選或基因過程開發(fā)產(chǎn)SOD量較高的菌株。目前，研究開發(fā)最多的資源還是從動物血液、動物組織中制備提純SOD。從動物血液材料中制備CuZnSOD純化工藝分為三個主要步驟：（1）原材料的預(yù)處理；（2）粗酶液的制備；（3）離子交換柱層析精制。國內(nèi)多采用Mccd和Fridovich法，其主要工藝過程為：第一步，乙醇氯仿除去血紅蛋白；第二步，有機溶劑和硫酸銨分級沉淀；第三步，離子交換柱層析精制。[試劑和器材試劑和器材]1、試劑3.8%

3、（質(zhì)量分數(shù)）檸檬酸三鈉；0.9%（質(zhì)量分數(shù)）氯化鈉；95%（體積分數(shù)）乙醇；氯仿；丙酮；pH7.6、2.5mmolLK2HPO4KH2PO4緩沖液；DEAESephadexA502、器材豬血；恒溫水??；離心機；布氏漏斗；抽濾瓶；燒杯、量筒、攪棒等；透析袋[方法和步驟方法和步驟]1、從豬血中提取SOD（1）分離血球取新鮮豬血，加入到3.8%檸檬酸三鈉抗凝液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3：1，輕輕攪拌均勻，4000rmin離心20min，收

4、集紅血球。（2）除血紅蛋白紅血球用3倍體積生理鹽水洗滌，4000rmin離心20min，重復(fù)三次，然后向洗凈的紅血球加入1～1.1倍體積去離子水，攪拌溶血30min，再向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預(yù)冷95%乙醇和0.15倍體積的預(yù)冷氯仿，劇烈攪拌15min左右，靜置1h，然后4000rmin離心20min除去變性血紅蛋白沉淀，取清液，過濾，收集濾液（記3鹽酸把pH調(diào)至7.6，滴定可在pH計上進行，須使懸液最終pH在10min內(nèi)

5、無變化，然后抽濾。（6）將上述濾塊置于100毫升量筒中，加入75mL緩沖液I，慢慢攪混之后，靜置20min，用傾斜法除去上清液中細微粒子，如此重復(fù)若干次，最后上清液pH與緩沖液I幾乎一致。2、裝柱（1）層析柱用洗滌液洗清潔，柱的下端聯(lián)接塑料管，裝上螺旋夾。關(guān)上螺旋夾，柱內(nèi)裝入緩沖液I，微開螺旋夾。讓緩沖液緩慢流出，趕走死區(qū)及塑料管中的氣泡，柱中保留少量緩沖液，關(guān)閉螺旋夾。（2）將基本平衡好的DEAE纖維素漿液（約有1倍體積的緩沖液I）放

6、在抽濾瓶中減壓除盡氣泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高約1cm高度時，部分旋松螺旋夾，讓溶液緩慢流出去，注意此時的流速要比正常洗脫時的流速慢，陸續(xù)加入較多的漿液，直至達到高10cm以上的柱床體積。3、平衡當(dāng)全部交換劑裝入柱中后，用上柱起始緩沖液進行平衡。流速可維持在4mL15min，直至流出液的pH與上柱緩沖液完全相同。（一般要平衡8h以上或過夜。）4、層析用毛細吸管小心吸去交換劑上面大部分液體，打開出口使緩沖液Ⅰ恰流到表面，關(guān)閉出口

7、。用毛細吸管小心地沿柱壁四周緩緩加入SOD粗酶液，打開出口，使樣品溶液進入纖維素內(nèi)，至幾乎露出床面時，柱壁用少量緩沖液小心洗滌2～3次，然后裝入緩沖液Ⅰ，使液面高出創(chuàng)面2～3cm左右。5、洗脫（1）按圖將梯度洗脫器和層析柱連接好。（2）在洗脫瓶A（貯存器）和洗脫瓶B（混合器）內(nèi)各裝入100mL緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ，注意兩洗脫瓶，特別是液面應(yīng)處于同一水平面，同時應(yīng)排除連接管內(nèi)氣泡。（3）開動電磁攪拌器開關(guān)，調(diào)節(jié)攪拌速度，以混合器內(nèi)緩沖液旋轉(zhuǎn)