污染物去甲基化表觀遺傳毒性EGFP評(píng)價(jià)載體的構(gòu)建及性能測(cè)試.pdf

1、目的：構(gòu)建用于評(píng)價(jià)去甲基化表觀遺傳污染物健康損害風(fēng)險(xiǎn)的真核表達(dá)載體。
　　 方法：經(jīng)過(guò)大腸桿菌擴(kuò)增后大量提取pEGFP-C3質(zhì)粒；對(duì)pEGFP-C3質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，膠回收目的雙酶切短片段；并對(duì)其中EGFP基因啟動(dòng)子區(qū)DNA片段實(shí)施定向甲基化處理。隨后將其與雙酶切長(zhǎng)片段回復(fù)連接成環(huán)，膠回收重組質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒的高甲基化狀態(tài)。將甲基化處理重組pEGFP-C3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG-2細(xì)胞，以5-AZA為陽(yáng)性去甲基化毒物與轉(zhuǎn)染細(xì)胞

2、共培養(yǎng)，通過(guò)亞硫酸氫鈉測(cè)序法定量檢測(cè)EGFP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR定量檢測(cè)EGFP基因表達(dá)，借助流式細(xì)胞術(shù)和熒光定量攝片定量檢測(cè)共培養(yǎng)細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度，在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表達(dá)、GFP蛋白等多個(gè)層次研究5-AZA染毒處理與其去甲基化能力的響應(yīng)關(guān)系。
　　 結(jié)果：雙酶切和亞硫酸氫鈉測(cè)序結(jié)果表明pEGFP-C3質(zhì)粒GFP基因啟動(dòng)子區(qū)處于高甲基化狀態(tài)。高甲基化pEGFP-C3質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hep

3、G2肝癌細(xì)胞株，并在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表達(dá)、GFP蛋白多個(gè)層次對(duì)EGFP基因表達(dá)情況進(jìn)行了成功的檢測(cè)。當(dāng)5-AZA的染毒梯度為0.0016，0.008，0.004，0.2uM時(shí)，其染毒量與基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，EGFP基因mRNA表達(dá)、GFP蛋白熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。C3質(zhì)粒EGFP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與5-AZA處理濃度存在線性相關(guān)，線性方程為y=-0.1962x+0.856；R2=0.800。EGFP表達(dá)

4、相對(duì)量和5-AZA劑量梯度成良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，y=1.359Ln(x)+8.0869，R2=0.6569。細(xì)胞GFP熒光強(qiáng)度均數(shù)與5-AZA存在良好的劑量效應(yīng)線性關(guān)系，線性方程為y=10.402x+6.0334；R2=0.829。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了高甲基化的綠色熒光蛋白的報(bào)道基因載體，并且其在真核細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光蛋白基因表達(dá)與陽(yáng)性受試去甲基化污染物存在比較靈敏的響應(yīng)關(guān)系。敏感、穩(wěn)定的高甲基化pEGFP-C3質(zhì)粒載體為研究