三種不同因子對(duì)三角帆蚌外套膜細(xì)胞ca2+流動(dòng)性的影響

1、1?三種不同因子對(duì)三角帆蚌外套膜細(xì)胞三種不同因子對(duì)三角帆蚌外套膜細(xì)胞Ca2流動(dòng)性流動(dòng)性的影響的影響施志儀郝瑩瑩李文娟韓健靳雨麗（上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與養(yǎng)殖生態(tài)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海201306）關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞三角帆蚌；外套膜細(xì)胞；非損傷微測(cè)；Ca2流動(dòng)性三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國(guó)主要的育珠母蚌，其所培育出的珍珠色澤鮮艷、細(xì)膩光滑，因而成為目前淡水育珠生產(chǎn)中首選的育珠母蚌之一。蚌的外套膜是貝殼和珍珠形成的重

2、要組織器官，有內(nèi)外兩層表皮細(xì)胞及其間的結(jié)締組織構(gòu)成。它對(duì)鈣具有高度通透性[1~3]，其上皮細(xì)胞具有通過(guò)細(xì)胞膜主動(dòng)吸收Ca2和貯存Ca2的功能[4]，并通過(guò)胞吐作用排出鈣至外套膜外腔中，這些鈣就是形成珍珠的基礎(chǔ)。維生素D3可促進(jìn)Ca2的吸收和增加鈣的運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)鈣吸收起著重要作用[5]。對(duì)貝類(lèi)的研究表明，適量維生素D3能夠促進(jìn)礦物質(zhì)在貝殼中的沉積[6]。而促進(jìn)貝殼和珍珠很好的生長(zhǎng)的一個(gè)不容忽視的因素是環(huán)境中的鈣濃度[7~9]，水體環(huán)境Ca2升

3、高，可增加外套膜組織Ca2濃度[10]。研究表明，60~80mgL的Ca2濃度最有利于促進(jìn)三角帆蚌珍珠質(zhì)沉積[11]。此外，溫度對(duì)外套膜細(xì)胞的珍珠質(zhì)的沉積也有影響[12]，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響珍珠質(zhì)分泌，甚至造成蚌體死亡。非損傷微電極測(cè)定技術(shù)(Noninvasivemicrotesttechnology，NMT)在細(xì)胞和組織水平進(jìn)行功能鑒定、跨膜生物信息傳遞機(jī)制研究等方面發(fā)揮了重要的作用[13]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多研究者運(yùn)用NMT對(duì)生物

4、Ca2流動(dòng)進(jìn)行了研究。本研究運(yùn)用NMT在不同濃度Ca2、維生素D3以及不同溫度的培養(yǎng)條件下，研究三角帆蚌外套膜細(xì)胞外的Ca2的流動(dòng)特性，以期為三角帆蚌Ca2代謝的分子調(diào)控機(jī)制的研究提供資料，也為日后提高珍珠培育產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)采用2齡的活力較強(qiáng)的三角帆蚌，蚌體大小(長(zhǎng)寬高為1183cm)，由浙江諸暨養(yǎng)殖基地提供，育珠蚌在小型玻璃水族缸(403020cm)中暫養(yǎng)，所用的都是曝氣的自來(lái)水，調(diào)節(jié)其含鈣量約為1.25mmolL。本試驗(yàn)所

5、用試劑和儀器有：維生素D3(上海生工)，二甲基亞砜(DMSO)(天根生化科技)，RPML1640培養(yǎng)基、抗生素(青霉素、鏈霉素各10000Uml)、優(yōu)級(jí)胎牛血清(上海博升生物)，胰蛋白酶、EDTA（Gibco公司)，全培養(yǎng)基(RPML164020%胎牛血清200Uml雙抗[14])，0.25%的胰酶(含有0.02%EDTA)，VD3孵育液用二甲基亞砜溶解為40000UL的儲(chǔ)液，Ca2孵育液用無(wú)水CaCl2配成為0.5molL的儲(chǔ)液，測(cè)試

6、液使用無(wú)Ca2Hanks(C0218，碧云天)配成。恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(REVCO，美國(guó))，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，非損傷微電極測(cè)定(BI0001系列，美國(guó)揚(yáng)格公司)，超凈工作臺(tái)中(蘇州凈化設(shè)備廠)。外套膜組織細(xì)胞的培養(yǎng)：取3只蚌用手術(shù)刀切開(kāi)蚌的閉殼肌，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗外套膜，采用撕裂法分離出外套膜外表皮[15]，再浸入雙蒸水配制的0.01%高錳酸鉀溶液中30?收稿日收稿日期：期：20100725接受日期：接受日期：2010

7、0902本研究由上海市博士后科研資助計(jì)劃面上項(xiàng)目(No.09R21413200)，上海市科委基礎(chǔ)重大項(xiàng)目(No.06aj14003)和上海市重點(diǎn)學(xué)科水生生物學(xué)建設(shè)(No.S30701)資助項(xiàng)目?通訊作者。通訊作者。Tel:02161900051Email:zyshi@shou.3P0.05)differentlettersexpressverysignificantlydifference(P0.01).水體Ca2的濃度對(duì)外套膜細(xì)胞胞外

8、Ca2流動(dòng)有顯著的影響(P0.05)。如圖3所示，隨著孵育液中Ca2濃度增大，外套膜外的Ca2外排速度減小，Ca2運(yùn)動(dòng)方向也由外排變?yōu)閮?nèi)流。當(dāng)Ca2濃度增大時(shí)，去極化電位增大，電壓依賴(lài)性鈣通道打開(kāi)，膜電壓也發(fā)生了改變，引起Ca2的大量?jī)?nèi)流[17]。本研究數(shù)據(jù)顯示，在添加Ca2濃度為0.5mmolL時(shí)，細(xì)胞處于Ca2外排狀態(tài)，平均流速為190.86.9pmolcm2s1；當(dāng)Ca2濃度增大為1.25mmolL時(shí)，細(xì)胞仍處于Ca2外排狀態(tài)，平