利用srap分子標(biāo)記分析種質(zhì)資源 實(shí)驗(yàn)方案

1、利用SRAP分子標(biāo)記分析種質(zhì)資源1SRAP分子標(biāo)記分子標(biāo)記相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）是由美國加州大學(xué)Li和Quiros于2001年發(fā)展的一種基于PCR反應(yīng)的新型標(biāo)記。該技術(shù)是基于正向和反向引物對模板DNA的PCR擴(kuò)增，引物具有3個明顯不同的序列框(motif)：5’端存在的1011個隨機(jī)堿基序列，緊跟著CCGG（正向引物）或AATT（反向引物）的堿基序列，最后是位于3’端的3個選擇性堿基。從技術(shù)的可操作性來看，每個引物5’端的10個

2、隨機(jī)堿基序列可以促進(jìn)任意序列的擴(kuò)增，即類似于RAPD標(biāo)記的結(jié)果。正向引物的CCGG序列可以優(yōu)先與具有豐富GC堿基的外顯子序列退火結(jié)合，而反向引物的AATT序列可優(yōu)先與具有豐富AT堿基的內(nèi)含子和啟動子序列退火結(jié)合，引物3’端的3個選擇性堿基可以對模板DNA進(jìn)行選擇。SRAP標(biāo)記自開發(fā)以來，已在多種植物的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建和物種親緣關(guān)系分析研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。該標(biāo)記具有操作簡便、快速，多態(tài)性豐富，重復(fù)性好，不需預(yù)知物種序列信息

3、以及成本較低等優(yōu)點(diǎn)，具有RAPD簡單快捷之優(yōu)點(diǎn)，同時還具有AFIP的穩(wěn)定性和多態(tài)性，是簡單又經(jīng)濟(jì)、有效又可靠的分子標(biāo)記系統(tǒng)。2.1材料和試劑材料和試劑2.1.1材料材料從各種中各隨機(jī)選取515株個體采集葉片用于提取基因組DNA。2.1.2儀器與試劑儀器與試劑研缽、冷凍高速離心機(jī)、水浴鍋、紫外分光光度計、電泳槽、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀液氮、離心管（1.5mL、10mL）、PCR管、燒杯、容量瓶、試劑瓶、量筒氯化鈉、EDTA二鈉鹽、

4、醋酸鈉、Tris、CTAB、鹽酸、β巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、冰醋酸、無水乙醇、PCR試劑、瓊脂糖（1）2CTAB提取液配制2CTAB提取液配制2CTAB提取液終濃度母液5ml10ml15ml20ml（7）加RNaseA至終濃度10gml，37C消化30min；（8）加等體積氯仿、異戊醇混合液（24:1），翻轉(zhuǎn)充分搖勻，室溫離心10min（12000rmin1）；（13）取上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，加入.8V冷異丙醇（或2V預(yù)

5、冷的無水乙醇）0.1V3MNaAc沉淀DNA，輕輕翻轉(zhuǎn)搖勻，20C冰箱過夜；（14）4C離心15min（12000rmin1），棄上清，70%預(yù)冷乙醇洗滌沉淀兩次，無水乙醇洗滌一次，并自然風(fēng)干；（15）加入100μlTE溶液，冷凍備用?；蚪MDNA濃度檢測用紫外分光光度計（日本島津UV2401PC）測定260nm280nm處的光吸收值，根據(jù)A260A280確定DNA的純度，根據(jù)260nm處的光吸收值估測樣品DNA的濃度；用1.0%瓊脂糖

6、凝膠電泳法檢測DNA的純度和濃度來檢測其純度和濃度，根據(jù)電泳條帶的整齊度、點(diǎn)樣孔中熒光的有無估計DNA的純度，根據(jù)條帶的亮度估測DNA的濃度。2.3PCR反應(yīng)體系及程序反應(yīng)體系及程序用于PCR擴(kuò)增的DNA模板的濃度稀釋至20ngl，用于SRAP分析。在0.2mlRCR管內(nèi)配置20ul反應(yīng)體系H2O12.4l10PCRBuffer2.0l50dNTPMix(10mMeach)0.4l（0.2mMeach）PCRPrimer1(10M)1.