發(fā)酵工程第5講課件

1、2013.3.28 第五講 第七章 發(fā)酵過程的工藝控制,第七章 發(fā)酵過程的工藝控制 1、溫度對(duì)發(fā)酵過程的影響及其控制 2、CO2對(duì)發(fā)酵過程的影響及其控制 3、泡沫對(duì)發(fā)酵的影響 4、O2對(duì)發(fā)酵過程的影響及其調(diào)控 5、pH對(duì)發(fā)酵過程的影響及其控制,發(fā)酵的過程實(shí)質(zhì)上是在分子水平的遺傳

2、特性，細(xì)胞水平的代謝調(diào)節(jié)和工程水平的傳遞特性三個(gè)不同水平上發(fā)生調(diào)控的。發(fā)酵過程受到多因素交叉的影響具有不確定性和復(fù)雜性。,1 溫度對(duì)發(fā)酵的影響及其控制,不同微生物的生長對(duì)溫度的要求不同，根據(jù)它們對(duì)溫度的要求大致可分為四類：嗜冷菌適應(yīng)于0～260C生長，嗜溫菌適應(yīng)于15～430C生長，嗜熱菌適應(yīng)于37～650C生長，嗜高溫菌適應(yīng)于650C以上生長,,每種微生物對(duì)溫度的要求可用最適溫度、最高溫度、最低溫度來表征。在最適溫度下，微生物生長迅

3、速；超過最高溫度微生物即受到抑制或死亡；在最低溫度范圍內(nèi)微生物尚能生長，但生長速度非常緩慢，世代時(shí)間無限延長。在最低和最高溫度之間，微生物的生長速率隨溫度升高而增加，超過最適溫度后，隨溫度升高，生長速率下降，最后停止生長，引起死亡。,微生物受高溫的傷害比低溫的傷害大，即超過最高溫度，微生物很快死亡；低于最低溫度，微生物代謝受到很大抑制，并不馬上死亡。這就是菌種保藏的原理。,1.1 溫度對(duì)發(fā)酵的影響 溫度是影響有機(jī)體

4、生長繁殖最重要的因素之一，因?yàn)槲⑸锏纳L和代謝產(chǎn)物的合成都是在各種酶的催化下進(jìn)行的，溫度是保證酶活性的重要條件。發(fā)酵過程的反應(yīng)速率實(shí)際是酶反應(yīng)速率，酶反應(yīng)有一個(gè)最適溫度。 溫度對(duì)發(fā)酵的影響是多方面的。,1.1.1 溫度對(duì)微生物細(xì)胞生長的影響： 在適合微生物生長的范圍內(nèi)，溫度高微生物生長速度快、呼吸強(qiáng)，酶失活速度快，菌體提前衰老。溫度低，發(fā)酵周期延長，影響設(shè)備的利用率。不同生長

5、階段的微生物對(duì)溫度的反應(yīng)也不一樣。 如延滯期的細(xì)菌對(duì)溫度很敏感，最適溫度時(shí)，可以縮短其生長的延滯期，低于最適溫度，延滯期就會(huì)延長。微生物的共同特點(diǎn)是：對(duì)低溫的適應(yīng)力要強(qiáng)于對(duì)高溫的適應(yīng)力。,1.1.2 溫度對(duì)產(chǎn)物形成的影響： 溫度對(duì)產(chǎn)物的影響因種而異，如：檸檬酸生產(chǎn)，黑曲霉的生長最適溫度33 ℃~37 ℃，積累酸的最適溫度為32 ℃ ，若溫度高于32 ℃ ，菌體生長快，糖被利用于生成菌體和呼

6、吸作用，產(chǎn)酸降低。,1.1.3 溫度影響發(fā)酵方向,四環(huán)素產(chǎn)生菌金色鏈霉菌同時(shí)產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素，當(dāng)溫度低于300C時(shí)，這種菌合成金霉素能力較強(qiáng)；溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高，溫度達(dá)到350C時(shí)，金霉素的合成幾乎停止，只產(chǎn)生四環(huán)素。溫度還影響氧在基質(zhì)中的溶解度，氧在發(fā)酵液中的溶解度也影響菌對(duì)某些基質(zhì)的分解吸收。因此對(duì)發(fā)酵過程中的溫度要嚴(yán)格控制。,1.2 最適溫度的選擇,1.2.1 根據(jù)菌種及生長階段選擇,微生物種類不同，所具有的酶

7、系及其性質(zhì)不同，所要求的溫度范圍也不同。如黑曲霉生長溫度為370C，谷氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌的生長溫度為30～320C，青霉菌生長溫度為300C。,在發(fā)酵前期由于菌量少，發(fā)酵目的是要盡快達(dá)到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長迅速；在中期菌量已達(dá)到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因?yàn)樵谏缘蜏囟认掳被岷铣傻鞍踪|(zhì)和核酸的正常途徑關(guān)閉得比較嚴(yán)密有利于產(chǎn)物合成。發(fā)

8、酵后期，產(chǎn)物合成能力降低，延長發(fā)酵周期沒有必要，就又提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。,如：青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)： 0～5小時(shí) 30℃， 6 ～35小時(shí) 25℃ 36 ～85小時(shí) 20℃ ， 86 ～126小時(shí) 25℃ 四環(huán)素生長階段28℃，合成期26℃后期再升溫；黑曲霉生長37℃，產(chǎn)糖化酶32～34℃。 但也有的菌種產(chǎn)物形成比生長溫度高。如谷氨酸產(chǎn)生菌生長30～32℃，產(chǎn)酸34～37℃。 最適溫度

9、選擇要根據(jù)菌種與發(fā)酵階段通過試驗(yàn)確定。,1.2.2 根據(jù)培養(yǎng)條件選擇,溫度選擇還要根據(jù)培養(yǎng)條件綜合考慮，靈活選擇。通氣條件差時(shí)可適當(dāng)降低溫度，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可髙些。培養(yǎng)基稀薄時(shí)，溫度也該低些。因?yàn)闇囟雀郀I養(yǎng)利用快，會(huì)使菌過早自溶。,1.2.3 根據(jù)菌生長情況菌生長快，維持在較高溫度時(shí)間要短些；菌生長慢，維持較高溫度時(shí)間可長些?？偟膩碚f，溫度的選擇根據(jù)菌種生長階段及培養(yǎng)條件綜合考慮。要通過反復(fù)實(shí)踐來定出最適溫

10、度。,1.3 引起發(fā)酵過程溫度變化的因素,發(fā)酵熱Q發(fā)酵,發(fā)酵熱是引起發(fā)酵過程溫度變化的原因。所謂發(fā)酵熱就是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生菌分解基質(zhì)產(chǎn)生熱量，機(jī)械攪拌產(chǎn)生熱量，而罐壁散熱、水分蒸發(fā)、空氣排氣帶走熱量。這各種產(chǎn)生的熱量和各種散失的熱量的代數(shù)和就叫做凈熱量。Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射,生物熱Q生物,在發(fā)酵過程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能

11、化合物（如ATP）提供細(xì)胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余部分以熱的形式散發(fā)出來，這散發(fā)出來的熱就叫生物熱。微生物進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多。,生物熱與發(fā)酵類型有關(guān),微生物進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多一摩爾葡萄糖徹底氧化成CO2和水好氧：產(chǎn)生287.2千焦耳熱量， 183千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?104.2千焦以熱的形式釋放厭氧：產(chǎn)

12、生22.6千焦耳熱量， 9.6千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?13千焦以熱的形式釋放二個(gè)例子中轉(zhuǎn)化為高能化合物分別為63.7％和42.6％,生物熱的產(chǎn)生具有強(qiáng)烈的時(shí)間性。在培養(yǎng)初期，菌體處于適應(yīng)期，菌數(shù)少，呼吸作用緩慢，產(chǎn)生熱量較少。菌體在對(duì)數(shù)生長期時(shí)，菌體繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌體也較多，所以產(chǎn)生的熱量多，溫度上升快，必須注意控制溫度。培養(yǎng)后期，菌體已基本

13、上停止繁殖，主要靠菌體內(nèi)的酶系進(jìn)行代謝作用，產(chǎn)生熱量不多，溫度變化不大，且逐漸減弱。,攪拌熱Q攪拌,在機(jī)械攪拌通氣發(fā)酵罐中，由于機(jī)械攪拌帶動(dòng)發(fā)酵液作機(jī)械運(yùn)動(dòng)，造成液體之間，液體與攪拌器等設(shè)備之間的摩擦，產(chǎn)生可觀的熱量。攪拌熱與攪拌軸功率有關(guān)，可用下式計(jì)算： Q攪拌= 3600（P/V） 3600：熱功當(dāng)量（kJ/（kW.h）） （P/V）：通氣條件下單位體積發(fā)酵液所消耗的功率（ kW/m3）,,,蒸發(fā)熱Q

14、蒸發(fā),通氣時(shí)，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所帶走的熱量叫蒸發(fā)熱。此外，排氣也會(huì)帶走部分熱量叫顯熱Q顯熱，顯熱很小，一般可以忽略不計(jì)。,輻射熱Q輻射,發(fā)酵罐內(nèi)溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。輻射熱的大小取決于罐溫與環(huán)境的溫差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超過發(fā)酵熱的5％。Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射,發(fā)酵熱的測定,有二種發(fā)酵熱測定的方法。一種是用冷卻水進(jìn)出口溫度差計(jì)算發(fā)酵熱。在工廠里，可以通過測量冷卻

15、水進(jìn)出口的水溫，再從水表上得知每小時(shí)冷卻水流量來計(jì)算發(fā)酵熱。Q發(fā)酵＝GCw(T出－T進(jìn))Cw—水的比熱 G—冷卻水流量,,另一種是根據(jù)罐溫上升速率來計(jì)算。先自控，讓發(fā)酵液達(dá)到某一溫度，然后停止加熱或冷卻，使罐溫自然上升或下降，根據(jù)罐溫變化的速率計(jì)算出發(fā)酵熱。Q發(fā)酵熱 =（M1C1 +M2C2 ）S M1 系統(tǒng)中發(fā)酵液的質(zhì)量（ kg）， M2發(fā)酵罐的質(zhì)量（ kg）， C1 發(fā)酵液的比熱， C2發(fā)酵罐材料的

16、比熱， S溫度上升的速率（ ℃/ h）,1.4 發(fā)酵過程溫度的控制發(fā)酵罐：夾套（5M3以下） 盤管（蛇管）（5M3以上）種子罐一般需升溫或降溫發(fā)酵罐一般只需降溫,2 CO2濃度對(duì)發(fā)酵的影響及其控制 2.1 CO2濃度對(duì)發(fā)酵的影響： CO2是微生物呼吸和分解代謝的終產(chǎn)物，同時(shí)也是某些合成代謝的一種基質(zhì)，幾乎所有的發(fā)酵都會(huì)產(chǎn)生CO2 溶解在發(fā)酵液中的CO2對(duì)氨基酸、抗生素微生物的發(fā)酵具有刺激和抑制作

17、用，大多數(shù)微生物適應(yīng)低濃度的CO2 （ 0.02%—0.04% V/V ）。,當(dāng)發(fā)酵液CO2濃度達(dá)到1.6 ×10-2 mol/L時(shí)，就會(huì)嚴(yán)重抑制酵母菌的生長， CO2分壓達(dá)0.08 ×105P，青霉素的比生長速率降低50%，出現(xiàn)膨脹菌絲，青霉素合成受阻。對(duì)發(fā)酵促進(jìn)。如牛鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)多糖，最重要的發(fā)酵條件是提供的空氣中要含5%的CO2 。,2.2 CO2影響微生物發(fā)酵的機(jī)制： CO2主要是影響細(xì)胞膜

18、的結(jié)構(gòu)，溶解在發(fā)酵液中的CO2主要作用于細(xì)胞膜的脂質(zhì)（脂肪酸核心部位），當(dāng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)相中CO2的濃度達(dá)到臨界值時(shí)，膜的流動(dòng)性及表面電荷就發(fā)生改變，使許多基質(zhì)的運(yùn)輸受到阻礙，影響細(xì)胞膜的運(yùn)輸效率，導(dǎo)致細(xì)胞生長受到抑制，形態(tài)發(fā)生改變。 此外， CO2影響發(fā)酵液的酸堿平衡，或與其它物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成碳酸鹽沉淀。,2.3 CO2濃度的控制 CO2溶解度比氧大，因此隨著發(fā)酵罐罐壓的增加其含量比氧增加得更快。 CO2濃度的變化受

19、許多因素的影響。如：細(xì)胞呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液流變學(xué)特征、通氣攪拌程度、罐壓大小等。,2.3.1 發(fā)酵過程通過通氣量的控制，可以調(diào)節(jié)CO2濃度的大小，通氣量大攪拌速度快CO2濃度就會(huì)減小。如：四環(huán)素發(fā)酵前40小時(shí)采用較小的通氣量和較低攪拌速度，增加發(fā)酵液中CO2的含量，40小時(shí)后再降低CO2的濃度，可提高四環(huán)素產(chǎn)量25%—30%。2.3.2 通過控制罐壓來調(diào)節(jié)CO2濃度：罐壓升高發(fā)酵液中CO2濃度增加，罐壓降低CO2濃度隨著下降。對(duì)CO

20、2濃度敏感的發(fā)酵生產(chǎn)不宜采用大高徑比的反應(yīng)器。罐內(nèi)的CO2分壓是液體深度的函數(shù)，10米高的罐中，在1.01×105P的氣壓下，罐底CO2分壓是頂部的2倍。,2.3.3 CO2濃度的產(chǎn)生與補(bǔ)料有密切的關(guān)系，如：青霉素發(fā)酵中，補(bǔ)料可增加發(fā)酵液中的CO2的含量和降低發(fā)酵液的pH。,3 泡沫對(duì)發(fā)酵的影響3.1 泡沫產(chǎn)生的原因：外力如通氣、攪拌；微生物的代謝產(chǎn)生CO2 、NH3；培養(yǎng)基中的復(fù)合氮源、糖和代謝物等有穩(wěn)定泡沫的

21、作用。同濃度下起泡能力最強(qiáng)的是玉米漿其次為花生餅粉、黃豆餅粉。,3.2 起泡的危害,3.2.1降低生產(chǎn)能力,在發(fā)酵罐中，為了容納泡沫，防止溢出而降低裝量，大多數(shù)罐的裝料系數(shù)在0.6—0.7，余下的空間用于容納泡沫。,3.2.2引起原料浪費(fèi),如果設(shè)備容積不能留有容納泡沫的余地，氣泡會(huì)引起原料流失，造成浪費(fèi)。,3.2.3 影響菌的呼吸,如果氣泡穩(wěn)定，不破碎，那么隨著微生物的呼吸，氣泡中充滿二氧化碳，而且又不能與空氣中氧進(jìn)行交換，這樣就

22、影響了菌的呼吸。,3.2.4 引起染菌,由于泡沫增多而引起逃液，于是在排氣管中粘上培養(yǎng)基，就會(huì)長菌。隨著時(shí)間延長，雜菌會(huì)長入發(fā)酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐頂進(jìn)一步滲到軸封，軸封處的潤滑油可起點(diǎn)消泡作用，從軸封處落下的泡沫往往引起雜菌污染。,3.3 泡沫的控制 3.3.1 機(jī)械消泡法：在攪拌上部安裝消泡槳將氣泡打碎。機(jī)械消泡節(jié)省原料，減少培養(yǎng)液性質(zhì)的變化，對(duì)提煉無副作用。但消泡的效果不如化學(xué)方法消泡。,3.3.2 消泡劑消泡 發(fā)

23、酵工業(yè)常用的消泡劑包括天然油脂類、聚醚類、高級(jí)醇類、硅樹脂類。天然油脂有玉米油、豆油、米糠油、魚油和豬油等，它們除消泡外還可以提供碳源。其消泡能力不強(qiáng)。應(yīng)用較多的是聚醚類消泡劑有聚氧丙烯甘油（GP）和聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE），它們按一定比例配制稱“泡敵”,消泡能力是天然油脂的10倍以上。 GP親水性差，分散系數(shù)小，在發(fā)泡介質(zhì)中溶解度小，其抑泡性能比消泡性能好，宜在配培養(yǎng)基時(shí)加入。 GPE的親水性好，在發(fā)泡介質(zhì)中易展開，作用

24、迅速并且消泡能力強(qiáng)，但其溶解度較大消泡維持的時(shí)間較短，所以在黏度較大的發(fā)酵液中使用效果較好。,4、氧對(duì)發(fā)酵的影響及其控制 在好氧深層發(fā)酵中，氧氣的供應(yīng)往往是發(fā)酵能否成功的重要因素之一。對(duì)多數(shù)好氧發(fā)酵來說，氧的不足會(huì)造成代謝異常，產(chǎn)量降低，氧氣被稱為好氧微生物發(fā)酵的限制因素。,4.1 氧的特性和傳質(zhì)： 在28℃100％的空氣飽和濃度情況下，氧在發(fā)酵液中只有7mg/L(0.25 mmol.L-1 )左

25、右，比糖的溶解度小7000倍。在對(duì)數(shù)生長期即使發(fā)酵液中的溶氧能達(dá)到100％空氣飽和度，若此時(shí)中止供氧，發(fā)酵液中溶氧可在幾分鐘內(nèi)便耗竭，使溶氧成為限制因素。 因此，發(fā)酵過程中需連續(xù)不斷通氣攪拌，以滿足微生物的生長，通常情況生物氧化中氧吸收效率多低于1%，99%的無菌空氣浪費(fèi)。,4.2 微生物對(duì)氧的利用： 不同微生物對(duì)氧的需求不同。微生物對(duì)氧的利用可由以下關(guān)系式進(jìn)行計(jì)算。 微生物的耗氧速度常用比耗氧速率來表示：即單位質(zhì)

26、量的細(xì)胞（干重）在單位時(shí)間內(nèi)消耗氧的量（呼吸強(qiáng)度）。（1） QO2 =(QO2 ）max × CL /(K0 +CL ） QO2比耗氧速率(mmol O2/g菌·h)，CL溶解氧濃度， K0氧的米氏常數(shù)（ mol/ m3 ），(QO2）max 最大比耗氧速率(mmol O2/g菌·h )： 啤酒酵母為：2.2 ×10-3，黑曲霉為： 8.

27、3 ×10-4,（2）攝氧率：γ= QO2 X γ攝氧率（mmol O2/L·h） ：單位體積培養(yǎng)液在單位時(shí)間內(nèi)消耗的氧量。 X細(xì)胞濃度，kg(干重)/m3。（3）CCr臨界氧濃度：指不影響菌的呼吸所允許的最低氧濃度。,,,,CCr,QO2,CL各種微生物CCr : 細(xì)菌和酵母3%～10%，放線菌5%～30%，霉菌10% ～15%例：酵母 4.6×10-3 mmol.L-1產(chǎn)黃青

28、霉 2.2×10-2 mmol.L-1,,,（4）氧飽和度：發(fā)酵液中氧的濃度/臨界溶氧溶度,所以對(duì)于微生物生長，只要控制發(fā)酵過程中氧飽和度>1.,注意： 細(xì)胞濃度直接影響培養(yǎng)液的攝氧率，在分批發(fā)酵中攝氧率變化很大，不同生長階段需氧不同，對(duì)數(shù)生長后期達(dá)最大值。 培養(yǎng)基的成分和濃度顯著影響微生物的攝氧率，碳源種類對(duì)細(xì)胞的需氧量有很大影響，一般葡萄糖的利用速度比其他的糖要快。,,,4.3 反應(yīng)器中氧的傳遞

29、在深層培養(yǎng)中進(jìn)行通氣供氧時(shí)，氧氣從氣泡到細(xì)胞需克服一系列阻力。氧從空氣泡到達(dá)細(xì)胞的總傳遞阻力為各阻力之和。,空氣→氣膜→氣液界面→液膜→液相主體→細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)表面的液膜→固液界面→細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的傳遞→細(xì)胞壁阻力→反應(yīng)阻力 傳遞過程的總推動(dòng)力就是氣項(xiàng)與細(xì)胞內(nèi)的氧分壓之差，當(dāng)氧的傳遞達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，總的傳遞速率與串聯(lián)的各步傳遞速率相等。,培養(yǎng)液中的氧傳遞速率=KL (C*-CL)根據(jù)亨利定律 ：P=HC﹡C*

30、＝P/H, 與氣相中氧分壓相平衡的液體中氧的濃度,,KL : 以氧濃度為推動(dòng)力的總傳遞系數(shù) (m/h)CL：液相溶解氧濃度。H亨利常數(shù)（Pa·L/Lmmol),,,以單位體積的液體中所具有的氧的傳遞面積為 a (氣液比表面積m2/m3)OTR=KLa (C* –CL ）OTR單位體積培養(yǎng)液中的氧傳遞速率， KLa以氧濃度為推動(dòng)力的容積氧傳遞系數(shù)， C*與氣相氧平衡時(shí)液相氧濃度（ mol/ m3 ）,4.4 影響Kla

31、的因素,Kla反映了設(shè)備的供氧能力，發(fā)酵常用的設(shè)備為搖瓶與發(fā)酵罐。,1.4.1影響搖瓶kla的因素,為裝液量和搖瓶機(jī)的頻率,4.4.2影響發(fā)酵罐供氧因素1.4.2.1 攪拌：攪拌功率增大對(duì)氧的利用效果明顯，但過于激烈的攪拌，產(chǎn)生很大的剪切力，可能對(duì)細(xì)胞造成損傷。另外，激烈的攪拌會(huì)產(chǎn)生大量的攪拌熱。增加傳熱的負(fù)擔(dān)。 KLa =K(PG/V) αωsβ

32、 K常數(shù)， PG攪拌功率，V培養(yǎng)液體積， ωs通氣的表觀線速度，α ，β為指數(shù)，六箭葉渦輪：α：0.755， β：0.578,4.4.2.2 空氣流量： KLa隨著空氣流量的增加而增加，但通氣量的影響是有一定限度的，如果超過在一限度，攪拌器就不能有效的將空氣泡分散到液體中，而在大量的空氣泡中空轉(zhuǎn)，發(fā)生“過載”大的氣泡沿周圍逸出。4.4.2.3 培養(yǎng)液性質(zhì)的影響：在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的性質(zhì)如：密度、黏度、表面張力、擴(kuò)

33、散系數(shù)等都會(huì)影響KLa 在其他條件相同時(shí)，液體的黏度增大時(shí)，傳質(zhì)阻力就增大。,4.4.2.4 微生物生長的影響：細(xì)胞濃度增加， KLa值逐漸變小4.4.2.5 溫度的影響：溫度降低可得到較高的氧溶解度，但需考慮對(duì)微生物生長的影響。,實(shí)例：黑曲霉生產(chǎn)糖化酶 n 230 230 270 通氣比 1:0.8

34、 1:1.2 1:0.8 產(chǎn)量 1812 2416 2846,提高攪拌速率, 比提高通氣比有效,4.5 改善供氧條件的新措施4.5.1 氧載體：氧載體一般指不溶于培養(yǎng)基但能夠吸附或包裹氧的物質(zhì)?？勺鳛檠踺d體的液體有烷烴和全氟化碳（PFCS )。研究表明：氣升式發(fā)酵罐氧載體最適添加量，正十二烷為3%，全氟化碳為2%。4.5.2 導(dǎo)入血

35、紅蛋白：將血紅蛋白基因克隆到大腸桿菌和放線菌，可促進(jìn)有氧代謝、菌體生長和抗生素的合成。,5 pH值對(duì)發(fā)酵過程的影響及其調(diào)控,,,,pH是微生物代謝的綜合反映，它對(duì)菌體的生長和產(chǎn)品的積累有很大的影響。所以是十分重要的參數(shù)。,發(fā)酵過程中pH是不斷變化的，通過觀察pH變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否,5.1 發(fā)酵過程pH值變化的原因,5.1.1 基質(zhì)代謝,5.1.1.1 糖代謝：特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上

36、升，是補(bǔ)料的標(biāo)志之一5.1.1.2 氮代謝：氨基酸被利用后產(chǎn)生NH3 ， pH會(huì)上升；尿素被分解成NH3，pH上升。5.1.1.3 生理酸、堿性物質(zhì)利用后pH會(huì)上升或下降,5.1.2 產(chǎn)物形成,某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化，如有機(jī)酸類產(chǎn)生使pH下降。紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。,5.1.3 菌體自溶 pH上升，發(fā)酵后期，pH上升。 5.1.4 雜菌的污染 pH下降,5.2 p

37、H值對(duì)發(fā)酵的影響,5.2.1 pH影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷。從而改變細(xì)胞膜的透性，影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進(jìn)行,5.2.2 pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用,5.2.3 pH值影響代謝方向 pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。例如黑曲霉在pH2~3時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，在pH近中性時(shí)，則產(chǎn)生草酸。谷氨酸發(fā)酵，在中性和微堿性條件

38、下積累谷氨酸，在酸性條件下則容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。,5.2.4 pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有不同的影響,pH對(duì)菌體生長影響比產(chǎn)物合成影響小例 青霉素：菌體生長最適pH3.5~6.0,產(chǎn)物合成最適pH7.2~7.4 四環(huán)素：菌體生長最適pH6.0~6.8，產(chǎn)物合成最適pH5.8~6.0,,5.3 最佳pH的確定,配制不同初始pH的培養(yǎng)基，搖瓶考察發(fā)酵情況,pH對(duì)產(chǎn)海藻酸裂解酶的影響,5.4 pH值的控制,5.4

39、.1 調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH(特別注意C/N)。基礎(chǔ)料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須注意調(diào)節(jié)pH。,5.4.2 在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)，如CaCO3 ，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等,5.4.3 通過補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH，在發(fā)酵過程中根據(jù)糖氮消耗需要進(jìn)行補(bǔ)料。 5.4.4 發(fā)酵的不同階段控制不同的pH值,第八章 微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué) 微生物發(fā)酵反應(yīng)體系中有細(xì)胞的生長，基質(zhì)消耗和產(chǎn)物的生成。 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是對(duì)

40、微生物的生長及和產(chǎn)物形成的描述，它研究細(xì)胞生長速率和發(fā)酵產(chǎn)物的生成速率以及環(huán)境條件對(duì)這些速率的影響。并建立反應(yīng)速度與影響因素的關(guān)聯(lián),XS（底物） X（菌體） ＋ P（產(chǎn)物）,,1、微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的內(nèi)容、方法、目的 1.1 內(nèi)容：細(xì)胞生長、死亡動(dòng)力學(xué)；基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)；氧消耗動(dòng)力學(xué)；CO2生成動(dòng)力學(xué)；產(chǎn)物合成和降解動(dòng)力學(xué)等。 以上各方面不是孤立的，而是既相互依賴又相互制約，構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜、豐富多彩的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)體

41、系。,1.2 方法：a.收集發(fā)酵過程變化的第一手資料（菌體濃度、基質(zhì)濃度、時(shí)間、 pH、溶氧、CO2生成等）；b.找出各參數(shù)之間相互變化規(guī)律；c.建立各種“數(shù)學(xué)模型”以定量描述各參數(shù)隨時(shí)間變化的規(guī)律；d.通過計(jì)算機(jī)在線控制并按照數(shù)學(xué)模型所給出的控制規(guī)律去調(diào)節(jié)或控制生產(chǎn)過程。,數(shù)學(xué)模型：是描述生產(chǎn)過程控制規(guī)律的一些數(shù)學(xué)和邏輯算式。 1.3 目的：根據(jù)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型來設(shè)計(jì)程序，建立發(fā)酵過程中工藝參數(shù)的控制最優(yōu)化方案，從而為發(fā)酵過程

42、的工藝設(shè)計(jì)和管理控制提供理論基礎(chǔ)，達(dá)到提高產(chǎn)品產(chǎn)率，降低成本的目的。,2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的分類 Gaden分類法 類型 產(chǎn)物形成與底物利用的關(guān)系 實(shí)例 Ⅰ 產(chǎn)物形成與底物利用直接相關(guān) 乙醇、乳酸等 Ⅱ 產(chǎn)物形成與底物利用間接相關(guān) 檸檬

43、酸、谷氨酸等 Ш 產(chǎn)物形成與底物利用不相關(guān) 青霉素、鏈霉素等,,,,,,,,Ⅰ型為生長聯(lián)系型，又稱簡單發(fā)酵型，產(chǎn)物直接由碳 源代謝而來，產(chǎn)物生成速度的變化與微生物對(duì)碳源

44、利用速度的變化是平行的，產(chǎn)物生成與微生物的生長,也是平行的。在這些發(fā)酵過程中，菌體的生長、基質(zhì)的消耗、產(chǎn)物的生成三個(gè)速度都有一個(gè)高峰，三高峰幾乎同時(shí)出現(xiàn)。 Ⅱ 型為部分生長聯(lián)系型，又稱中間發(fā)酵型，產(chǎn)物不是碳源的直接氧化產(chǎn)物，而是菌體代謝的主流產(chǎn)物。它的特點(diǎn)是在發(fā)酵的第一時(shí)期碳源大量消耗用于菌體的迅速增長而產(chǎn)物的形成很少或全無，第二時(shí)期碳源大量消耗用于產(chǎn)物的高速合成及菌體的生長。,Ш 型為非生長聯(lián)系型，又稱復(fù)雜發(fā)酵型，產(chǎn)物的生成在菌體

45、生長和基質(zhì)消耗完以后才開始，與菌體生長不相關(guān)，與基質(zhì)消耗無直接關(guān)系，所形成的產(chǎn)物為次級(jí)代謝產(chǎn)物。,3 分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué) 3.1 分批培養(yǎng)菌體的生長動(dòng)力學(xué)：在分批培養(yǎng)中就細(xì)胞濃度X的變化而言，一般經(jīng)歷延遲期、對(duì)數(shù)期、減速期、靜止期、衰亡期。 分批培養(yǎng)菌體的生長速率(g/L. h) ：dx/dt X —菌體濃度（ g/L ） μ—比生長速率(1/h) : 單位重量的菌體瞬時(shí)增量

46、,3.1.1 延遲期：延遲期的長短與種子的種齡和接種量的大小有關(guān)，而培養(yǎng)基的濃度對(duì)延遲期的長短影響不大。 dx/dt≈03.1.2 對(duì)數(shù)期：營養(yǎng)豐富，有毒代謝物少，細(xì)胞生長不受限制，細(xì)胞濃度隨培養(yǎng)時(shí)間呈指數(shù)增長。 μ = μm 細(xì)胞濃度的倍增時(shí)間(td ) td=ln2/ μm =0.693/ μm,微生物細(xì)胞的倍增時(shí)間：細(xì)菌0.25—1h, 酵母1.1

47、5—2h 霉菌2—6h。哺乳動(dòng)物細(xì)胞15—100h。植物細(xì)胞24—74h3.1.3 減速期：培養(yǎng)基營養(yǎng)物迅速消耗，有害物質(zhì)逐漸積累，細(xì)胞比生長速率逐漸下降。當(dāng)培養(yǎng)基中不存在抑制細(xì)胞生長的物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞的生長速率與基質(zhì)濃度關(guān)系（Monod方程式）如下 S—基質(zhì)濃度(mol/m3)， KS —飽和常數(shù)(微生物對(duì)營養(yǎng)物利用常數(shù)）(mol/m3，大腸桿菌2.0—2.4 mg/L ，啤酒酵母25 mg

48、/L)，,（1—kp) k—抑制常數(shù)，p—產(chǎn)物濃度3.1.4 靜止期：細(xì)胞濃度達(dá)到最大值， μ= 0 3.1.5 衰亡期：環(huán)境惡化，細(xì)胞開始死亡，活細(xì)胞濃度不斷下降。目前工業(yè)大生產(chǎn)有關(guān)衰亡期研究不多。 dX/dt= μ X—kd X dx/dt <0 kd—死亡系數(shù)(1/h),如果細(xì)胞代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長有抑制作用，隨著這種產(chǎn)物的積累， μ逐漸下降，可用下方程表示,3.

49、2 分批培養(yǎng)產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)：產(chǎn)物生成與菌體生長有 相關(guān)、部分相關(guān)、不相關(guān)三種情況。其數(shù)學(xué)模型如下： a.相關(guān)：dp/dt=Yp/xdx/dt dp/dt = Yp/x μX qp= dp/(dt X)= Yp/x μ p—產(chǎn)物濃度（ g/L ） X —

50、菌體濃度（ g/L ） qp—產(chǎn)物比合成速率(1/h) dp/dt—產(chǎn)物合成速率(g/L h) dx/dt —細(xì)胞生長速率(g/L h) Yp/x —產(chǎn)物相對(duì)于細(xì)胞的得率系數(shù),b.部分相關(guān)： dp/dt=αμX +βX qp = αμ+ β α—生長相關(guān)的產(chǎn)物得率系數(shù)，由于相關(guān)性不同α≠Y

51、p/x β—非生長相關(guān)的比生產(chǎn)速率c.不相關(guān)： dp/dt= βX qp = β,〖Pirt方程〗,π＝a + bμ,β=0、α≠0： 可表示一類發(fā)酵,β≠0、α=0： 可表示三類發(fā)酵,β≠0、α≠0：可表示二類發(fā)酵,qp ＝ αμ+ β,3.3 分批培養(yǎng)基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)：微生物細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)極其復(fù)雜，總況可用： 碳源+氮源+氧 細(xì)胞+產(chǎn)物+CO2+H2O ΔC

52、+ ΔN+ ΔO ΔX+ ΔP+ Δ CO2 + Δ H2O 基質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的效率可用得率系數(shù)表示，得率系數(shù)指消耗單位營養(yǎng)物所生成的細(xì)胞或產(chǎn)物數(shù)量。 細(xì)胞生長得率系數(shù)：YX/S= ΔX/ ΔS 產(chǎn)物對(duì)于消耗基質(zhì)的得率系數(shù)： Yp/S= ΔP/ ΔS 細(xì)胞對(duì)于氧的得率系數(shù)：YX/o = ΔX/ ΔO,,,在分批發(fā)酵中，對(duì)碳源和能源的利用可分為三部分：一部分形成細(xì)胞物質(zhì)，一部分產(chǎn)生能量

53、供細(xì)胞維持生命活動(dòng)，一部分形成產(chǎn)物。 其方程式為： -ds/dt=(1/Y) dX/dt + mx +(1/Y) dp/dt m—細(xì)胞維持系數(shù)指維持細(xì)胞最低活性所需消耗的能量，一般來講，單位重量的細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)用于維持消耗所需的基質(zhì)的量是一個(gè)常數(shù)。 基質(zhì)比消耗速率 qs=-1/X . ds/dt 比生產(chǎn)速率 qp=1/X . dp/dt

54、,分批發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 操作簡單，周期短，染菌機(jī)會(huì)少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握。缺點(diǎn) 非生產(chǎn)時(shí)間較長、設(shè)備利用率低。,4 單罐連續(xù)培養(yǎng)動(dòng)力學(xué) 4.1 單罐連續(xù)培養(yǎng)菌體生長動(dòng)力學(xué)： 單罐連續(xù)培養(yǎng)：由于新鮮培養(yǎng)基不 斷補(bǔ)充，所以不會(huì)發(fā)生營養(yǎng)物的枯 竭，另一方面，發(fā)酵液不斷取出， 發(fā)酵罐內(nèi)的微生物始終處于旺盛 的指數(shù)生長期，罐內(nèi)細(xì)胞濃度X、 比生長速率μ、以及t, pH等都 保持恒定。流入速度=流出速度

55、=F,流入速度=流出速度=F,反應(yīng)器內(nèi)(V)全混流溶質(zhì)濃度處處相等,細(xì)胞濃度變化率=細(xì)胞生長率–細(xì)胞流出率–細(xì)胞死亡率 dX/dt= μX– (F/V) X–αX F—培養(yǎng)液體積流量（L/min, m3/min)， V—發(fā)酵罐體積（ m3 , L），X—出料中微生物細(xì)胞濃度（ g/L ，個(gè)/L）， α —微生物比死亡速率(1/h) ，F(xiàn)/V—稀釋率用D表示,X（

56、 μ – D – α ）= dX/dt 連續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，即恒化狀態(tài)。 dx/dt=0， μ=D – α ，不考慮死亡因素， μ=D 連續(xù)培養(yǎng)有自平衡能力。,4.2 單罐連續(xù)發(fā)酵基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)： 流入營養(yǎng)物—流出營養(yǎng)物—生長消耗營養(yǎng)物—維持生命營養(yǎng)物—形成產(chǎn)物消耗營養(yǎng)物=基質(zhì)營養(yǎng)物變化 (F/V ) S0 –(F/V ) S – μX/ YX/S – mX– qpx/ Yp/S = ds/dt

57、 S0 , S 為流入、流出營養(yǎng)物濃度（g/L），一般情況下， mX<< μX/ YX/S ，在恒定狀態(tài)下，ds/dt=0 D（ S0 – S）= μX/ YX/S + qpx/ Yp/S,4.3 單罐連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)： dp/dt= qpX–DP= qpX –(F/V) P 當(dāng)處于恒化狀態(tài)且加料中不含產(chǎn)物時(shí) dp/dt=0 qpX=( F/V) P

58、 qpX= DP,5 多罐串聯(lián)連續(xù)培養(yǎng)動(dòng)力學(xué) 5.1 多罐串聯(lián)菌體生長動(dòng)力學(xué)：第一罐與單罐情況相同。第二 罐： dX2/dt= (F/V ) X1 + μ2X2 –(F/V ) X2 恒化狀態(tài)時(shí)， dx2/dt=0 DX2 – D X1 = μ2X2 μ2=D（1 – X1/X2） X2 = D X1 /(D – μ2 ） 第n罐： μn =D（1

59、– Xn-1/ Xn ） Xn =D Xn-1/（ D – μn ）,5.2 多罐串聯(lián)基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)：第一罐與單罐情況相同。第二罐： -ds2/dt= (F/V) S1 – (F/V ) S 2 – μ2X2 / YX/S – qPX2/ YP/S 恒化狀態(tài)時(shí)-ds2/dt=0 D(S1 – S2)= μ2X2 / YX/S+ qpx2/ YP/S

60、 S2 = S1 – μ2X2 / DYX/S – qpx2/ DYP/S 第n罐： Sn =Sn-1 – μnXn/ DYX/S – qpxn/ DYP/S,5.3 多罐串聯(lián)產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)： 第一罐與單罐情況相同。 第二罐： dp2/dt= (F/V) P1+ qpX2 – (F/V ) P2 第n罐： Pn = Pn-1 + qp

61、Xn / D,連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：能維持低基質(zhì)濃度； 可以提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量； 便于自動(dòng)控制,缺點(diǎn)：菌種發(fā)生變異的可能性較大； 要求嚴(yán)格的無菌條件。,6 基因重組菌分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué) 基因重組菌質(zhì)粒存在分離、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，這種不穩(wěn)定與宿主菌、質(zhì)粒載體特性與培養(yǎng)條件密切的關(guān)系。 6.1 基因重組菌分離不穩(wěn)定培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)：設(shè)基因重組菌細(xì)胞的最大比生長速率為

62、μm+，濃度為X+，丟失質(zhì)粒的重組菌的最大比生長速率為μm-，濃度為X - ，丟失質(zhì)粒的概率為ρ， 則細(xì)胞濃度變化率：,dX+ /dt= μ+（1 – ρ） X+ d X - /dt= μX - + μ X+ ρ μ- / μ+ >1 基質(zhì)消耗速率： ds/dt=(1/Y )( dX+ /dt) +(1/Y)( d X - /dt ) +(1/Y) (dp/dt ),產(chǎn)物生成速率：

63、dp/dt= α( dX+ /dt) + β X+ α —生長關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物形成系數(shù)， β —非生長關(guān)聯(lián)的比生產(chǎn)速率。 產(chǎn)物的生成僅與帶有質(zhì)粒的細(xì)胞有關(guān)。,6.2 基因重組菌分離、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)： 設(shè)定正常的基因重組菌為X1，因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定質(zhì)粒已發(fā)生變化的基因重組菌為X2 ，其發(fā)生概率為θ。因分離不穩(wěn)定質(zhì)粒已發(fā)生丟失的基因重組菌為X3， X1→ X3發(fā)生概率為φ1 ， X2→ X3發(fā)生概率為φ2。

64、 X1 X2 X3,,,,菌體生長速率： d X1 /dt= μ1X1（1 – θ –φ1 ） d X2 /dt= μ2X2 （1 – φ2）+ μ1X1 θ d X3/dt= μ