2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、PBMC 分離及凍存流程PBMC 分離及凍存流程 分離及凍存流程本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心原理(Ficoll 密度為 1.077,PBMC 平均密度為 1.072) ,并通過(guò)反復(fù)離心洗滌,獲得相對(duì)較純的 PBMC。1. 試劑與耗材 試劑與耗材DPBS (PH=7.4, GIBCO, C14190),RPMI 1640 (GIBCO, C22400),F(xiàn)BS (GIBCO,10099),F(xiàn)icoll 分離液(LymphoprepTM, 11

2、14740) ,臺(tái)盼藍(lán)(Sigma, 117K2332) ,DMSO(Sigma, D5879-1l),15ml 和 50ml Falcon 離心管2. 緩沖液配置 緩沖液配置P0:即不含 FBS 的 PBSR0:即不含 FBS 的 RPMI 1640R10:即 10%FBS 的 RPMI 1640凍存液: 凍存液:即含 10%DMSO 的 FBS所有液體配置后 4°C保存,使用前 30 分鐘平衡至室溫。3. 分離步驟(以每

3、份血樣 分離步驟(以每份血樣 25ml 為例) 為例)1) 在分離前 30 分鐘,準(zhǔn)備超凈臺(tái),將緩沖液(P0, R10)和 Ficoll 分離液復(fù)溫至室溫;每個(gè)患者 20ml 的肝素鈉抗凝血(綠色帽管),需要 50ml 離心管 2 個(gè),15ml 離心管 3~4 個(gè)2) 登記樣本基本信息,姓名,ID 號(hào),采血日期; 3) 650g 離心 7min,30ml 血一共可留取 3~4ml 血漿(2ml ep 管 圓底的 3 管),以盡量不吸取到

4、紅細(xì)胞為原則,注意無(wú)菌操作,巴斯管不能伸進(jìn) ep 管。4) 吸取的血漿離心 3000rpm,10min,吸取上清。5) 每位患者需要分裝為 4 管血漿(1.5ml ep 管),血清視情況(10ml 普通帽管)而定,1.5ml 離心管每管 1ml;5ml 普通管中吸出 300~400ul 到 1.5ml EP 管中,標(biāo)記后和HBV DNA 申請(qǐng)單卷在一起,然后把 5ml 的普通管與雅培申請(qǐng)單卷在一起,送到血清室,反別放入相應(yīng)的盒子中(盒

5、子在臺(tái)上或在透明玻璃門(mén)冰箱里),血清血漿放到小實(shí)驗(yàn)室臥室冰箱中。6) 在 50ml 離心管中,加入 PBS(2 倍稀釋?zhuān)?,用巴斯管反?fù)混勻剩下的血,倒入離心管中,反復(fù)混勻再轉(zhuǎn)移至加入 5ml Ficoll 分離液的 15ml Falcon 離心管 3 或 4 管(這樣的分離效果會(huì)均勻一些,避免有一些管 PBMC 多一些)7) 個(gè)別患者離心完第 1 步之后可能會(huì)呈現(xiàn)云霧狀細(xì)胞團(tuán),吸取 PBMC 之后吹散即可,離心完第 2 步之后一定要徹底

6、打散細(xì)胞。)8) 將稀釋的血液緩慢加入 Ficoll 分離液的表面(傾斜 45 度);9) 按程序 1 離心(800 g,25 分鐘,室溫,加速/減速設(shè)置為 1);PBMC 分離及凍存流程10) 輕柔的收集淋巴細(xì)胞帶置于新的 50ml Falcon 離心管(1 支),并加入 PBS 至 50ml;盡量避免吸到分離液。11) 按程序 2 離心(1800 rpm,10 分鐘,室溫,加速/減速設(shè)置為 9);12) 棄去上清,輕彈管底打散細(xì)胞沉

7、淀,并將細(xì)胞在 4ml R10 及 16ml PBS 中重新混懸;13) 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(吸取 20ul 細(xì)胞懸液到計(jì)數(shù)板中,human fresh PBMC,稀釋 20 倍,校正);等記,每 5~8×106 個(gè)細(xì)胞為一管14) 按程序 3 進(jìn)行離心(1500 rpm,10 分鐘,室溫,加速/減速設(shè)置為 9);15) 棄去上清,輕彈管底打散細(xì)胞沉淀,按下一步實(shí)驗(yàn)要求用凍存液調(diào)整細(xì)胞濃度或凍存。4. 凍存步驟 存步驟1) 預(yù)先配制

8、相應(yīng)體積的凍存液,置 4℃冷卻;2) 在凍存管上標(biāo)記樣本姓名,凍存日期;3) 接上述第 15 步,按 6~8*106/ml 密度計(jì)算凍存管數(shù),按 1ml/tube 添加凍存液;4) 將添加凍存液的細(xì)胞輕柔混勻后,1ml/tube 分裝至細(xì)胞凍存管;5) 將凍存管置于細(xì)胞梯度凍存盒,后者置于-80℃冰箱(4 號(hào)) ;5. 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng)1) 全過(guò)程無(wú)菌操作,動(dòng)作輕柔細(xì)致;2) 實(shí)驗(yàn)前必須將各種緩沖液和 Ficoll 平衡至室溫,有必要

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