細胞凍存的方法與步驟

1、細胞凍存、解凍方法與細胞計數(shù)江蘇大學附屬醫(yī)院風濕科李晶〖返回主頁〗一、細胞冷凍保存一、細胞冷凍保存1.材料：生長良好之培養(yǎng)細胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO(SigmaDMSO(SigmaD2650)D2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene50000020)、0.4％（wv）trypanblue(GibcoBRL15250061)、血球計數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(KRYO10SeriesII)2、冷凍保存方法：（1）傳統(tǒng)方法:冷存管置于

2、4℃10分鐘20℃30分鐘80℃16～18小時(或隔夜)液氮槽vapphase長期儲存。20℃不可超過1小時，以防止胞內冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機等速降溫機以1～3℃分鐘之速度由室溫降至（80℃以下）120℃，再放在液氮槽vapphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。3、步驟：（1）冷凍前2448小時更換半量或全

3、量培養(yǎng)基，使細胞處于指數(shù)生長期。（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。（3）離心收集培養(yǎng)之細胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。（4）取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液（DMSO最后濃度為5～10％），使細胞濃度為1～5106cel

4、lsml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1～2mlvial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數(shù)、日期。然后進行凍存。4、注意事項：（1）欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80～90％致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。管外部，移入無菌操作臺內。（5）取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培

5、養(yǎng)容器內(稀釋比例為1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。（6）解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol)，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有510ml培養(yǎng)基之離心管內，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培

6、養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。三、細胞計數(shù)與存活測試三、細胞計數(shù)與存活測試1、原理：（1）計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。（2）血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm20.1mm=1.0x104ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內之細胞數(shù)目，乘

7、以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。（3）存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypanblue染料，如果細胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。計算細胞活率：活細胞數(shù)（活細胞數(shù)死細胞數(shù)）100%。計數(shù)應在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料；因為臺盼蘭對蛋白質有

8、很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準確。2、材料：0.4%wvtrypanblue(GibcoBRL15250061)；Erythosinbluishstain；取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH3647)溶于100mlCaMgfreesaline；血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometercov

9、erslip)；計數(shù)器(counter)；低倍倒立顯微鏡；粒子計數(shù)器(CoultercounterCoulterElectronics)。白細胞稀釋液（4%乙酸溶液）。3、步驟：、步驟：（1）取50μl細胞懸浮液與50μltrypanblue(Erythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。（2）取少許混合液(約15μl)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色