基于多色熒光檢測的微流控裝置同時測定單個細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化小分子物種(H2O2，Cys和GSH)研究.pdf

1、細(xì)胞的生命過程需要氧化、抗氧化小分子的協(xié)同參與，為了發(fā)現(xiàn)以往在細(xì)胞群體研究中因統(tǒng)計學(xué)檢測而被掩蓋或無法發(fā)現(xiàn)的生理機(jī)制，進(jìn)一步研究生理病理過程，需要準(zhǔn)確獲取單細(xì)胞內(nèi)這些小分子的種類和含量信息。但是，由于細(xì)胞體積小，細(xì)胞內(nèi)許多目標(biāo)小分子不僅濃度低、濃度差異大，而且反應(yīng)活性高、可以相互轉(zhuǎn)化、相互影響、無法擴(kuò)增等條件的限制，目前商品化儀器難以準(zhǔn)確定量單細(xì)胞內(nèi)這些小分子物種的含量，導(dǎo)致一些分析問題至今尚無解決良策。比如，過氧化氫(H2O2)是細(xì)胞

2、內(nèi)重要的氧化小分子，而谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）則是細(xì)胞中具有代表性的重要抗氧化小分子，它們的生理濃度水平與生物體的氧化還原平衡息息相關(guān)，并在一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。由于缺乏在單細(xì)胞水平上對它們同時測定的分析方法，目前還難以揭示這些小分子的氧化、還原損傷與降解機(jī)制，所以需要發(fā)展同時定量測定單細(xì)胞內(nèi)H2O2、GSH和Cys的分析方法和相應(yīng)儀器。微流控芯片作為一類以在微米尺度空間精確操控與平行化處理皮升到微升級

3、液體為特征的新興分析技術(shù)，因具有二維或三維通道結(jié)構(gòu)、通道尺寸與細(xì)胞尺度相當(dāng)、分析速度快、樣品和試劑消耗少、易于集成化等優(yōu)點(diǎn)，日漸成為單細(xì)胞研究的重要技術(shù)平臺。檢測器作為微流控芯片分析系統(tǒng)的重要組成，用來確定微流控芯片處理或分離的分析物的組成及含量。激光誘導(dǎo)熒光檢測因具有靈敏度高、適合超微體積樣品測定等優(yōu)點(diǎn)，而成為微流控芯片分析中常用的檢測手段。特別是高靈敏激光誘導(dǎo)熒光檢測器與具有高效化學(xué)分離特征的微流控芯片電泳的聯(lián)用，可以用于單細(xì)胞組分

4、分析，由此產(chǎn)生的方法和儀器具有低耗、快速、多組分高效分離、可定量和易于自動化整合等優(yōu)勢。但是，在對單細(xì)胞內(nèi)這些多組分小分子進(jìn)行同時檢測時，由于單細(xì)胞樣品往往需要不同染料或探針的多重標(biāo)記，使得這些分子的熒光特性各異，而現(xiàn)有的激光誘導(dǎo)熒光檢測器多是基于“單一波長激光激發(fā)、單色熒光檢測”，難以同時檢測與定量分析這些具有“不同激發(fā)、不同發(fā)射”多色熒光標(biāo)記的多組分小分子。
　　本研究分為三個部分：第一章緒論，首先簡單介紹了同時測定單細(xì)胞內(nèi)氧

5、化、抗氧化小分子物種的意義，目前常用檢測細(xì)胞內(nèi)氧化、抗氧化小分子物種的方法。然后介紹了微流控芯片電泳及其檢測技術(shù)，以及微流控芯片電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測單細(xì)胞內(nèi)氧化、抗氧化小分子物種的研究進(jìn)展。第二章針對目前微流控芯片電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測不適應(yīng)“不同激發(fā)、不同發(fā)射”多組分小分子同時檢測等問題，搭建了一種微流控多色熒光檢測裝置。該裝置具有可見、近紅外兩種波長激光同時激發(fā)，綠色、紅色和近紅外三色熒光同步檢測，以及激光對焦等功能，便于實現(xiàn)單細(xì)

6、胞內(nèi)“不同激發(fā)、不同發(fā)射”多組分小分子的在線、高靈敏同時檢測，有助于拓展微流控芯片電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測在單細(xì)胞組分分析等領(lǐng)域的應(yīng)用空間。第三章利用搭建的微流控多色熒光檢測裝置，結(jié)合液壓-電動門式進(jìn)樣方法及實驗室合成的熒光探針 FS、Cy-3-NO2，發(fā)展了一種在微流控芯片上實現(xiàn)單細(xì)胞進(jìn)樣、溶膜、電泳分離和單個小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)H2O2、Cys和GSH同時定量檢測的新方法。利用所建方法，研究了不同濃度的酒精刺激及水飛薊素保護(hù)條件下，100