細(xì)胞內(nèi)多種活性小分子(GSH、Cys、Hcy,NO、Ca2+)同時(shí)定量檢測(cè)的新方法研究.pdf

1、細(xì)胞是生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的基本單位，是生命科學(xué)研究的根本出發(fā)點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)源性小分子，如小分子硫醇（GSH、Cys、Hcy）、一氧化氮（NO）、鈣離子（Ca2+）等，是生命活動(dòng)過(guò)程中重要的活性小分子。這些活性小分子不僅參與細(xì)胞活化、調(diào)控等重要的生理過(guò)程，而且與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
　　其中，GSH不僅維持著生物體的氧化還原平衡，而且參與細(xì)胞凋亡等過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)能夠解除外源化合物的毒性; Cys和Hcy的生理濃度水平也

2、是重要的健康指標(biāo)，Cys缺乏與兒童生長(zhǎng)緩慢、造血功能減弱、嗜睡和肝臟損傷等病癥相關(guān)，而 Hcy濃度升高則是心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、老年癡呆癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子。NO作為重要的信號(hào)分子，在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、及免疫系統(tǒng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，且NO含量異常與心血管疾?。ǜ哐獕?、冠心病、心肌梗死、心絞痛等）、糖尿病、癌癥等疾病相關(guān)。Ca2+作為重要的第二信使，幾乎參與所有的生理調(diào)控，而且一些疾病的發(fā)生和發(fā)展都伴隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+分布和濃度的

3、大幅度變化。
　　另一方面，活性小分子在細(xì)胞中不僅共存，而且反應(yīng)活性高、彼此相關(guān)、相互協(xié)同，相應(yīng)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)具備高靈敏度、高選擇性以及有效分離性能。為揭示它們?cè)诩?xì)胞功能調(diào)控中的作用以及與疾病關(guān)聯(lián)，必須了解細(xì)胞內(nèi)該類物質(zhì)的定量信息、以及它們之間相互作用的真實(shí)信息，因此迫切需要發(fā)展高靈敏、多參數(shù)、可同時(shí)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)多種活性小分子（GSH、Cys、Hcy，NO、Ca2+）的新方法。本論文主要包括以下兩個(gè)部分：
　　第一章，鑒于細(xì)胞

4、內(nèi)小分子生物硫醇（GSH、Cys、Hcy）在細(xì)胞的氧化還原平衡、癌癥的發(fā)生發(fā)展中的重要作用及三者之間的密切關(guān)聯(lián)，發(fā)展了一種基于同位素質(zhì)譜探針的同時(shí)定量檢測(cè)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞內(nèi)GSH、Cys、Hcy三種小分子生物硫醇的LC/ESI-MS新方法。首先設(shè)計(jì)合成了N-苯硒基鄰苯二甲酰亞胺-d5（NPSP-d5）同位素探針，并與NPSP-d0組成同位素探針對(duì)；然后驗(yàn)證了（NPSP）同位素探針與生物硫醇的反應(yīng)機(jī)理，表征了其對(duì)生物硫醇的相對(duì)定量性，

5、證明了其避免生物硫醇氧化的有效性；最后利用NPSP同位素探針對(duì)對(duì)不同生物樣品內(nèi)的生物硫醇分別進(jìn)行衍生化標(biāo)記，并在混合后進(jìn)行一系列的樣品處理，最終通過(guò)已優(yōu)化的LC/ESI-MS方法實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品中多種小分子生物硫醇同時(shí)相對(duì)定量分析。
　　第二章，鑒于NO與Ca2+均為細(xì)胞內(nèi)重要的信使分子，且二者之間有著密切的關(guān)聯(lián)。本章建立了一種對(duì)單細(xì)胞內(nèi)NO和Ca2+同時(shí)定量檢測(cè)的微流控芯片電泳-激光誘導(dǎo)熒光（MCE-LIF）分析法。采用熒光探針3

6、-氨基-4-氨甲基-2’,7’-二熒光素乙酸鹽（DAF-FM DA）和1-[2-氨基-5-(2,7-二氯-6-羥基-3-氧-9-夾氧蒽基)苯氧基]-2-(2-氨基-5苯氧甲基)乙烷-N,N,N,’N,’-四乙酸，季四戊醇乙酰氧基甲基酯（Fluo-3 AM）分別對(duì)NO、Ca2+進(jìn)行熒光標(biāo)記。利用MCE-LIF，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞（4T1）內(nèi)NO和Ca2+的同時(shí)定量檢測(cè)，該方法為后續(xù)研究不同生理過(guò)程及生理狀態(tài)下NO與Ca2+的