HPLC測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH含量方法的建立及甘草次酸對(duì)砷干擾AC內(nèi)GSH合成的保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是維持細(xì)胞正常功能的自由基清除劑，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的保護(hù)作用。細(xì)胞內(nèi)GSH含量的測(cè)定方法常采用酶循環(huán)法、比色法、熒光光度計(jì)法等，而細(xì)胞內(nèi)GSH含量的高效液相色譜法（High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC）測(cè)定方法鮮有報(bào)道，因此建立高靈敏度、高特異性、高分辨率的HPLC法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH含量的方法有極其重要的作用。
　　砷是一

2、種神經(jīng)毒物。星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte，AC）是腦內(nèi)含量最多的細(xì)胞，位于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元之間，是血腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是砷通過(guò)血腦屏障遇到的首個(gè)實(shí)質(zhì)性的細(xì)胞。AC膜上存在谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（XAG-系統(tǒng)）和谷氨酸胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Xc-系統(tǒng)），具有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸(Glutamate，Glu)、半胱氨酸(Cysteine，Cys)及胱氨酸(Cystine，Cyss)的功能，在促進(jìn)GSH合成方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。腦內(nèi)突觸間隙Glu

3、的轉(zhuǎn)運(yùn)主要依賴于AC膜上的谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Glutamate/Aspartate transporter，GLAST/EAAT1）和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（Glutamate transporter-1，GLT-1/EAAT2）。而Xc-系統(tǒng)主要介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外Cyss和Glu的轉(zhuǎn)運(yùn)，其中xCT起關(guān)鍵作用。因此影響AC內(nèi)GSH合成的主要因素涉及EAAT1、EAAT2和xCT三種轉(zhuǎn)運(yùn)體，以及Cys、Glu和Gly三種合成GSH的前體物質(zhì)。<

4、br>　　甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)是甘草酸及其鹽的代謝產(chǎn)物，是甘草發(fā)揮藥效的主要活性成分。研究表明，GA可以影響AC膜上的EAAT1和EAAT2，但GA對(duì)砷的解毒作用是否是通過(guò)調(diào)節(jié)AC膜上EAAT1、EAAT2和xCT而影響GSH的合成而起到保護(hù)作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　綜上所述，本研究將建立HPLC檢測(cè)AC內(nèi)GSH含量的方法，探討GA對(duì)急性砷暴露AC內(nèi)GSH合成的影響，為細(xì)胞內(nèi)GSH水平的檢測(cè)、G

5、A對(duì)砷解毒作用的研究提供實(shí)驗(yàn)方法。
　　方法：
　　一、AC的培養(yǎng)、分離純化與鑒定
　　無(wú)菌條件下，將1～3天齡的Wistar胎大鼠，斷頭，取腦，剔除腦膜和血管，剪碎，吹打細(xì)胞，篩網(wǎng)過(guò)濾，差速貼壁1h左右，然后將細(xì)胞接種于6 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)7-9 d。待細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底后，傳代培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25％胰酶消化，等體積培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞后，將其轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，離心后制成單細(xì)胞懸液，接種至預(yù)鋪有多聚賴氨

6、酸的的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）免疫熒光染色鑒定AC純度。
　　二、細(xì)胞孵育及分組
　　1、不同濃度砷暴露對(duì)AC的影響
　　待純化的3代AC長(zhǎng)滿皿壁后，隨機(jī)分組，用以砷濃度計(jì)的DMEM培養(yǎng)液(0、50、100、200、400、600μmol/L)處理細(xì)胞4h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、GSH含量、LDH含量、EAAT1、EAAT2和xCT

7、蛋白水平指標(biāo)的檢測(cè)。
　　2、不同時(shí)間砷暴露對(duì)AC的影響
　　待純化的3代AC長(zhǎng)滿皿壁后，隨機(jī)分組，用以砷濃度計(jì)的DMEM培養(yǎng)液200μmol/L孵育細(xì)胞1、2、4和6h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行EAAT1、EAAT2和xCT蛋白水平指標(biāo)的檢測(cè)。
　　3、氨基酸（Amino acid，AA）誘導(dǎo)下，砷對(duì)AC的影響
　　待純化的3代AC長(zhǎng)滿皿壁后，隨機(jī)分組，用以砷濃度計(jì)的0和200μmol/L培養(yǎng)液孵育細(xì)胞3.5 h后，向

8、培養(yǎng)皿內(nèi)加或不加100μmol/L AA（由GSH合成前體氨基酸組成，Glu∶Gly∶Cyss=1∶1∶1），孵育30min后，收集細(xì)胞，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、GSH含量、LDH活力及膜完整性、EAAT1、EAAT2和xCT蛋白水平指標(biāo)的檢測(cè)。
　　4、AA誘導(dǎo)下，GA對(duì)砷致AC損傷的保護(hù)作用
　　為研究GA對(duì)AC的保護(hù)作用，AC用10μmol/L的GA預(yù)處理20 min，然后將AC暴露200μmol/L的砷，染毒結(jié)束前30min

9、，各皿加入終濃度為100μmol/L的AA，共孵育4h，收集細(xì)胞，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、GSH含量、LDH活力及膜完整性、EAAT1、EAAT2和xCT蛋白水平指標(biāo)的檢測(cè)。
　　三、檢測(cè)指標(biāo)與方法
　　1、建立HPLC檢測(cè)AC內(nèi)GSH含量的方法
　　2、LDH法檢測(cè)細(xì)胞活力
　　3、倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)及膜完整性（PI和H33342法）
　　4、Western Bloting法檢測(cè)AC內(nèi)EAAT1、EAA

10、T2和xCT的蛋白水平表達(dá)
　　四、統(tǒng)計(jì)分析
　　實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（即mean±SD）表示，采用SPSS17.0軟件單因素方差分析方法（ANOVA）進(jìn)行各指標(biāo)組間差異的顯著性檢驗(yàn)，用最小顯著差數(shù)法（Least Significant Difference，LSD）兩兩比較，以P＜0.05作為檢驗(yàn)的顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　一、HPLC測(cè)定AC內(nèi)GSH含量方法的建立及含量測(cè)定
　　結(jié)果表明，G

11、SH在2～50μmol/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1.95X+0.4693(r=0.9983)，檢測(cè)限為0.5μmol/L。GSH衍生物準(zhǔn)確度在±15％范圍內(nèi)，日內(nèi)、日間精密度值均在2.6％～5.2％范圍內(nèi)，AC樣品回收率在95.4％～97.3％之間。表明測(cè)定AC內(nèi)GSH的分析方法精密度、準(zhǔn)確度良好及回收率較高。
　　AC砷暴露4h，砷可引起AC內(nèi)GSH水平明顯升高。AA對(duì)由砷引起AC內(nèi)GSH水平增加有協(xié)同作用;GA

12、可引起AC內(nèi)GSH水平的增加，對(duì)砷引起的AC內(nèi)GSH水平增加有增強(qiáng)作用。
　　二、GA對(duì)砷致AC內(nèi)GSH合成的影響
　　AC砷暴露4h，隨砷濃度的增加LDH水平逐漸增加，死亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，AC中EAAT1和EAAT2蛋白表達(dá)水平隨著砷染毒濃度的增加而明顯降低，xCT蛋白表達(dá)水平隨砷濃度的增加而逐漸升高。增加砷染毒時(shí)間，發(fā)現(xiàn)EAAT1和EAAT2蛋白表達(dá)受抑制，但對(duì)AC上的xCT蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用。
　　在AA誘導(dǎo)下