丹參乙酸鎂對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：糖尿病患者高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與糖尿病及其包括動(dòng)脈粥樣硬化等一些并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。盡管目前有多種抗氧化劑應(yīng)用于防治糖尿病及其并發(fā)癥，但相當(dāng)一部分抗氧化藥物不具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和增加機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的作用。在臨床上用于防治多種疾病的中藥丹參的單體丹酚酸B，通常以其鏌鹽丹參乙酸鎂(magnesiumlithospermateB,LAB)的形式存在，具有很強(qiáng)的抗氧化性，研究發(fā)現(xiàn)LAB可以通過(guò)多種機(jī)制抑制高血糖引起的血管損害，從而

2、減緩高血糖誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)以人胚腎細(xì)胞（HEK293T）細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)一步證實(shí)LAB對(duì)氧化應(yīng)激下細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)產(chǎn)生的影響；同時(shí)以血紅素加氧酶(hemeoxygenase，HO-1)為靶點(diǎn)，觀察LAB對(duì)高糖誘導(dǎo)下HO-1表達(dá)的調(diào)控，并進(jìn)一步研究LAB調(diào)控HO-1的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1．ROS檢測(cè)：收集處理好的細(xì)胞，向細(xì)

3、胞內(nèi)加入終濃度為lOμmol/LDCFH-DA探針共孵育30min，DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被ROS氧化生成有熒光的DCF。裝載并洗滌未裝載DCFH-DA探針后，在激發(fā)波長(zhǎng)488nm、發(fā)射波長(zhǎng)525nm條件下，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度。
　　 2．運(yùn)用QRT-PCR以及Westernblotting檢測(cè)高糖及LAB干預(yù)對(duì)HEK293T細(xì)胞內(nèi)HO-1基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

4、r>　　 3．檢測(cè)LAB對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子E2p45相關(guān)因子2(nuclearfactorE2-relatedfactor2，Nrt2)的核移作用。分別用高糖及不同濃度的LAB干預(yù)HEK293T細(xì)胞，用細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒，抽提核內(nèi)總蛋白質(zhì)，運(yùn)用Westernblotting檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)的影響。
　　 4．采用PCR、轉(zhuǎn)化、測(cè)序等技術(shù)構(gòu)建pRNAT-U6.1/Neo-siNrf2真核表達(dá)載體，并將No

5、n-specificcontrolshRNA陰性對(duì)照載體、pRNAT-U6.1/Neo-siNrf2真核表達(dá)載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后，用高糖及50μmol/LLAB干預(yù)HEK293T細(xì)胞，Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．與對(duì)照組(30.72+-0.47％)相比，30mmol/L高糖組（79.00+-5.8％）以及100μmol/

6、LH2O2組（92.83+-8.9％）細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量明顯增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與30mmol/L高糖組（79.00+-5.8％）相比，LAB預(yù)處理組(27.41+-4.13％)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量有回落的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與100μmol/LH2O2組（92.83+8.9％）相較；LAB干預(yù)組(43.66+-5.27％)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量也有回落的趨勢(shì)，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01

7、)。
　　 2．HEK293T細(xì)胞給予高糖刺激后，HO-1mRNA表達(dá)上調(diào)，于24h達(dá)到高峰，48h有所下降，高糖作用2h，6h，24h，48h和對(duì)照組比較，HO-1mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.96+-0.71，9.57+-1.39，12.29+-2.54，7.80+-0.40，（P值分別為0.022，0.003，0.000）。蛋白變化趨勢(shì)與HO-1mRNA相同，高糖作用第2h,6h，24h和48h，對(duì)照組的HO-1與β-act

8、in蛋白表達(dá)量的比值分別為0.087+-0.01，0.326+-0.092，0.718+-0.206，0.889+-0.128，0.274+-0.036，其中高糖培養(yǎng)6h和24h明顯增加HO-1蛋白表達(dá)(P<0.01)。HEK293T細(xì)胞預(yù)先30min給予不同濃度的LAB干預(yù)后,HO-1mRNA均有不同程度的增加，10μmol/L，50μmol/L，100μmtmol/L劑量的LAB干預(yù)組HO-1Mrna相對(duì)表達(dá)量分別為1.37+-0.

9、32，1.69+-0.31，2.19+-0.26，相較于高糖對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.045，P<0.015，P<0.000)。HO-1蛋白變化趨勢(shì)與Mrna相同，高糖對(duì)照組與10μmol/L，50μmol/L，100μmol/L劑量的LAB干預(yù)組HO-1與β-actin蛋白表達(dá)量的比值分別為0.853+-0.107，0.977+-0.061，1.156+-0.0182，1.470+-0.138。10μmol/L丹參乙酸鎂干預(yù)

10、組HO-1蛋白水平與高糖組比較沒(méi)有顯著性差異，在50μmol/L和100μmol/L時(shí)，LAB干預(yù)組較高糖對(duì)照組顯著增加(P值分別為0.021,0.001)。
　　 3．HEK293T細(xì)胞給予高糖刺激24h后，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核內(nèi)量增加(P<0.05)，相對(duì)于高糖對(duì)照組,50μtmol/L，100μmol/LLAB干預(yù)組轉(zhuǎn)位細(xì)胞核內(nèi)Nrf2量進(jìn)一步增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015，P=0.000)。