麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子死亡機制的探究.pdf

1、黃曲霉（Aspergillus flavus）作為一種腐生絲狀致病真菌，常見于發(fā)霉的糧食和豆類和堅果表面，其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素（aflatoxins）對人類和動物的肝臟具有很強的致癌性能夠?qū)е缕淇焖偎劳?。一些抗菌劑（伏立康唑）常用于治療黃曲霉的感染。然而，最近研究表明黃曲霉對唑類藥物產(chǎn)生耐藥性從而導(dǎo)致臨床治療真菌感染的失敗。因此，深層次地了解黃曲霉的死亡機制有助于新的殺菌藥物研發(fā)。麝香草酚（Thymol），主要存在于唇形科百里

2、香屬植物中，是百里香屬植物精油的主要成分。研究表明麝香草酚可以有效抑制細(xì)菌、霉菌和酵母的生長。本研究發(fā)現(xiàn)麝香草酚能夠誘導(dǎo)黃曲霉孢子的裂解死亡，為了進一步探究其作用機理，本文深度研究了麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子的死亡方式以及可能的作用靶標(biāo)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴麝香草酚對黃曲霉表現(xiàn)出了高效的抑菌效應(yīng)：當(dāng)濃度大于80μg/ml幾乎完全抑制黃曲霉孢子的生長。通過孢子活力分析發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理導(dǎo)致超過99.9%的黃曲霉孢子死亡。掃描電鏡結(jié)

3、果顯示麝香草酚能夠?qū)е曼S曲霉孢子發(fā)生裂解。 ROS和NO作為細(xì)胞內(nèi)的信號分子，經(jīng)常被報道與細(xì)胞的死亡相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的麝香草酚可以誘導(dǎo)黃曲霉孢子產(chǎn)生大量的ROS和NO，而且ROS和NO產(chǎn)生的抑制劑均可以顯著降低麝香草酚的這種殺菌效應(yīng)。ROS抑制劑還可以抑制NO產(chǎn)生。由此可見ROS可能通過誘導(dǎo)NO產(chǎn)生，參與麝香草酚對黃曲霉孢子的致死作用。⑵真核細(xì)胞的死亡方式包含多種，總的來講包含細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。通過Hoechst33342和PI

4、雙染，我們采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡對麝香草酚處理后黃曲霉孢子的早期生理活動進行了觀察。結(jié)果表明麝香草酚處理3h孢子就開始發(fā)生凋亡；并且隨著時間延長凋亡比例顯著增加，在處理6h后大部分孢子已處于凋亡狀態(tài)。通過Tunnel染色發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理9h后黃曲霉孢子出現(xiàn)了凋亡的另外一個特征：DNA斷裂現(xiàn)象；通過 JC-1熒光探針標(biāo)記，我們發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理導(dǎo)致線粒體的膜電位減弱，這說明線粒體膜可能受到了損傷。真核生物線粒體損傷會釋放細(xì)胞色素c到細(xì)胞

5、質(zhì)中并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase），啟動細(xì)胞凋亡通過caspase9檢測試劑盒，我們發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理后黃曲霉孢子中caspase9的活性急劇增加通過使用不可逆的 Caspase廣譜抑制劑氟甲基酮（Z-VAD-FMK）抑制 Caspase的活性，發(fā)現(xiàn)caspase9的活性受到顯著抑制，而且發(fā)生細(xì)胞凋亡的孢子數(shù)量明顯減少。這就進一步表明麝香草酚可能誘導(dǎo)黃曲霉孢子線粒體損傷最終導(dǎo)致了凋亡發(fā)生。⑶為了進一步探索麝香草酚誘

6、導(dǎo)黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡的潛在靶標(biāo)，在人體蛋白-藥物互作數(shù)據(jù)庫DRAR-CPI中檢索能夠與麝香草酚進行分子互作的蛋白。從中發(fā)現(xiàn)人體中電壓門控鉀離子通道蛋白（PDB id:1ZSX）可以與麝香草酚誘互作，而且與黃曲霉中的KCNAB具有較高的同源性。電壓門控鉀離子通道蛋白經(jīng)常被報道與細(xì)胞凋亡的啟動有關(guān)。隨后我們通過同源建模構(gòu)建了KCNAB的三級結(jié)構(gòu)，并通過模擬分子對接發(fā)現(xiàn)麝香草酚與黃曲霉的KCNAB的互作，發(fā)現(xiàn)其作用方式跟其與人體1ZSX中的作

7、用方式類似。通過 K+熒光探針 PBFI標(biāo)記,我們發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理導(dǎo)致孢子內(nèi)鉀離子濃度瞬間升高；當(dāng)外源添加電壓門控鉀離子通道抑制劑（4-氨基吡啶）時可以抑制鉀離子濃度的增高，而且同時顯著降低了凋亡的孢子數(shù)量。這些結(jié)果有力支持了生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果：麝香草酚可以與KCNAB互作，其結(jié)果促進黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡。⑷鑒于KCNAB在麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡中的作用，我們研究了KCNAB在黃曲霉的一些生理功能。我們使用黃曲霉CA14Δpyr

8、G ku70作為母本菌株構(gòu)建了缺失突變體ΔKCNAB。結(jié)果顯示KCNAB缺失導(dǎo)致黃曲霉孢子萌發(fā)紊亂：在蒸餾水中萌發(fā)而在培養(yǎng)中萌發(fā)受阻。進一步研究發(fā)現(xiàn)缺失突變體對洋蔥表皮和花生的侵染力顯著降低。這很可能是由于KCNAB作為電壓門控鉀離子通道β亞基其缺失會導(dǎo)致通道對外界刺激過度反應(yīng)。使用麝香草酚處理突變體，發(fā)現(xiàn)突變體的 K+激發(fā)現(xiàn)象更加明顯，而且凋亡現(xiàn)象更加顯著。這不僅證實了我們關(guān)于通道過度反應(yīng)的猜想，而且進一步支持了電壓門控鉀離子通道蛋白