某些重要金屬蛋白功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其分子機制研究.pdf

1、金屬蛋白是指以金屬離子或者其金屬團簇為輔基或輔因子的蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)的整體框架中，有近一半屬于金屬蛋白。它們的功能多種多樣，涉及生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、電子傳遞、氧化應(yīng)激、基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)/能量代謝等各個方面。金屬蛋白常常處于生理與病理過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，金屬蛋白的表達，定位，分布及其結(jié)構(gòu)與功能的改變與生理/病理變化密切相關(guān)。金屬蛋白對金屬離子往往擁有特異選擇性，而金屬離子的結(jié)合又能誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)與功能的變化。本文對生理/病理過程中某些重

2、要功能的金屬蛋白進行了克隆、表達與純化;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)表征;結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及相關(guān)分子機制展開深入研究。詳細內(nèi)容如下:
　　第一章詳細綜述了金屬蛋白的結(jié)構(gòu)特點與生理功能;目前金屬蛋白研究的熱點領(lǐng)域以及金屬蛋白研究中常用的方法手段。
　　第二章和第三章系統(tǒng)地研究了人病原體微生物艱難梭菌（C.difficile）超氧化物歧化酶(SODcd)的結(jié)構(gòu)、功能與抑制及其金屬特異性分子機制。C.difficile是一種耐藥性厭氧芽孢桿菌

3、，容易感染服用了抗生素的病人，引發(fā)嚴重假膜結(jié)腸炎（癌）。第二章中，我們首次克隆表達了SODcd，解析了它的晶體結(jié)構(gòu)，測定了其SOD酶活性，利用蛋白質(zhì)虛擬對接計算和等溫量熱滴定的方法探索了2-甲氧基雌二醇(2-ME)對MnSODcd酶活的抑制，發(fā)現(xiàn)2-ME可以結(jié)合在MnSODcd的二聚界面上（解離常數(shù)為～8.6μM），從而干擾兩個MnSODcd單體金屬中心之間的聯(lián)系，達到抑制其活性的效果。我們同時發(fā)現(xiàn)SODcd的金屬中心可被多種金屬離子占

4、據(jù)，但是只有Mn和Fe離子是活性金屬，Co、Cu、Ni離子替代Mn的SODcd沒有SOD活性。該SODcd表現(xiàn)出顯著的金屬特異性，結(jié)合錯誤的金屬會導(dǎo)致活性降低或失活。因此，第三章詳細研究了SODcd金屬特異性的分子機制。金屬平衡透析，蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光，變溫CD光譜實驗表明Apo-SODcd竟然對Co2+的親和力最大，而且Co2+-sub-MnSODcd在熱力學(xué)上最穩(wěn)定。這個結(jié)果同時被DFT計算得到的金屬取代反應(yīng)自由能所確認。為了進一步研究

5、SODcd金屬反應(yīng)性，我們用蛋白質(zhì)酸變性的方法制備了Mn2+，F(xiàn)e3+，Co2+單一金屬占據(jù)的SODcd，金屬離子的純度用ICP-MS，UV/Vis，EPR等方法表征。酶活性實驗顯示MnSODcd的活性最高，F(xiàn)e-sub-MnSODcd的活性只有MnSODcd的1/10，而Co-sub-MnSODcd完全沒有活性！這三種SODcd的晶體結(jié)構(gòu)顯示它們的金屬中心都呈現(xiàn)三角雙錐五配位狀態(tài)，其附近均存在一個由Tyr60，Tyr64，Gln178

6、以及金屬離子配位溶劑水組成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。晶體結(jié)構(gòu)和DFT NBO計算結(jié)果顯示這個氫鍵網(wǎng)絡(luò)存在區(qū)別:對于Gln178-H2O氫鍵強度:MnSODcd＜Fe-sub-MnSODcd＜Co-sub-MnSODcd;對于Gln178-Tyr64氫鍵強度:MnSODcd＞Fe-sub-MnSODcd＞Co-sub-MnSODcd。SOD的歧化反應(yīng)需要金屬中心的氧還電勢處在超氧陰離子氧化(0.89 V)和還原(-0.16 V)電勢的中點。Gln178

7、-H2O氫鍵可以通過調(diào)節(jié)金屬離子的氧化還原電勢來影響SOD活性;另一方面，Gln178-Tyr64氫鍵通過定位活化底物結(jié)合從而影響活性。我們通過電化學(xué)和光譜滴定研究表明MnSODcd的活性中心具有最佳的歧化電勢和最高的底物結(jié)合常數(shù)，這可以解釋這三種SODcd的活性差異。綜合實驗結(jié)果，金屬的內(nèi)在屬性（d電子構(gòu)型，配位化學(xué)）和SODcd精細的氫鍵網(wǎng)絡(luò)共同決定了SODcd的金屬特異性，這個推論也被SODcd反應(yīng)過渡態(tài)自由能所支持。這些結(jié)果為M

8、nSODcd特異性的抑制劑開發(fā)提供了基礎(chǔ)。
　　第四章研究了人病原體微生物梅毒螺旋體（T.pallidum）TroR金屬依賴的DNA結(jié)合性質(zhì)。梅毒螺旋體是造成人梅毒的病原菌。TroR是一種調(diào)節(jié)金屬內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的負反饋基因轉(zhuǎn)錄因子:當(dāng)細胞內(nèi)金屬離子濃度高時，它能被激活發(fā)生構(gòu)象變化，從而結(jié)合ATPase型金屬轉(zhuǎn)運蛋白troABCD上游回文序列，抑制其表達，降低金屬的攝取;當(dāng)金屬濃度低時，它能夠去抑制，導(dǎo)致troABCD表達上升。我們利用

9、一種新穎的“雙標簽”方法成功地在大腸桿菌中可溶性表達了TroR蛋白。研究表明TorR能夠結(jié)合Co2+，Ni2+，Mn2+，但不能結(jié)合Zn2+。變溫CD，ANS熒光實驗表明只有Co2+和Mn2+能夠造成TroR構(gòu)象變化。通過定點突變研究，發(fā)現(xiàn)TroR第11位天冬酰胺殘基對其金屬結(jié)合和構(gòu)象變化有重要的影響。EMSA，熒光各向異性以及ITC實驗結(jié)果表明只有在Mn2+存在下，TroR才能結(jié)合troABCD啟動子DNA。因此，TroR是錳離子特異

10、性依賴的金屬調(diào)控蛋白。
　　第五章詳細研究了淀粉樣前體蛋白(APP)和死亡受體因子6(DR6)介導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機制。APP是一種含有多個胞外結(jié)構(gòu)域的單次跨膜蛋白。APP可以在各種細胞器膜系統(tǒng)中被分選和加工形成多種具有獨立功能的片段，如sAPPα和sAPPβ等。據(jù)報道，在神經(jīng)營養(yǎng)缺乏的條件下，小鼠背根神經(jīng)脊APP可以被切割成～35 kD的N端片段(N-APP)，它可以與DR6相互作用，啟動下游caspase通路，從

11、而造成神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)突修剪。本章研究了N-APP與DR6結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);AD病人大腦中過載的Cu2+，Zn2+對其作用有何影響以及N-APPs細胞毒性的分子機制。運用生物物理技術(shù)（ITC，F(xiàn)RET，晶體結(jié)構(gòu)，小角散射，蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)對接技術(shù)）表征了N-APP和DR6相互作用以及Cu2+，Zn2+對這種作用的影響。我們提出了APP18-286結(jié)合DR6胞外富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)的結(jié)構(gòu)模型，顯示～35 kDAPP18-286主要通過

12、APP18-126的表面疏水口袋和APP210-286富含負電荷酸性區(qū)結(jié)合DR6 CRD。Cu2+，Zn2+可以聯(lián)合促進這種結(jié)合。神經(jīng)瘤細胞和原代神經(jīng)元毒性實驗表明N-APPs可以通過與DR6相互作用，激活caspase通路和誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生協(xié)同造成神經(jīng)元的凋亡和軸突的修剪。N-APP/DR6相互作用模型和細胞實驗結(jié)果將為基于結(jié)構(gòu)的AD拮抗劑開發(fā)提供基礎(chǔ)。
　　據(jù)報道，APP E2結(jié)構(gòu)域（簡稱E2）具有亞鐵氧化酶活性，與膜鐵

13、轉(zhuǎn)運蛋白(FPN1)作用介導(dǎo)細胞內(nèi)Fe2+外排，防止細胞內(nèi)Fe2+的聚集和氧化應(yīng)激，從而有利于腦鐵穩(wěn)態(tài)平衡。但是隨后另一課題組卻反駁E2的亞鐵氧化酶活性，他們認為E2甚至不能結(jié)合Fe2+。Fe在生物體內(nèi)的價態(tài)變化涉及到其轉(zhuǎn)運，儲存，外排和氧化應(yīng)激等各個過程。第六章初步探索了E2在腦鐵穩(wěn)態(tài)平衡中作用。光譜滴定，EPR，ITC，電化學(xué)等實驗表明E2雖然不結(jié)合Fe2+，但是能夠結(jié)合Fe3+。而且可以降低Fe3+/Fe2+的氧還電勢，減少Fe3