類葉升麻苷對(duì)魚(yú)藤酮致shsy5y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

1、hypertensive patients and 125 healthy volunteers . Sta2tistical analyses include one2 wayANOVA andχ2 analy2sis . Results The A rg16Gly and Gln27Glu poly mor2phis m s were in Hardy2 W einberg equilibrium. The al2lele freq

2、uency of 27Glu in the patients with hyperten2sion and obesity was 0. 069 and significantly higherthan that in the patients with hypertension and that inthe healthy volunteers ( P < 0105 ). Further studyshowed that thi

3、s association bet ween Gln27Glu poly2morphis m s and obesity existed only in male hyperten2sive patients, but not in females . Moreover, there wasno association bet weenβ 2 2 adrenoceptor haplotypes andobesity in our stu

4、dy . Conclusions These data suggestthat the Gln27Glu poly morphis m of β 2 2 adrenoceptorm ight be a major factor which contributes to obesitysusceptibility in male hypertensive subjects .Key words β 2 2 adrenoceptor; g

5、enetic poly morphis m;haplotypes; obesity; hypertension類葉升麻苷對(duì)魚(yú)藤酮致 SH2 SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用楊芳艷 , 蒲小平(北京大學(xué)藥學(xué)院分子與細(xì)胞藥理學(xué)系 ,北京 100083)中國(guó)圖書(shū)分類號(hào) : R 282171; R 28411; R 329125; R 745170513文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 : A 文章編號(hào) : 1001 - 1978 (2006) 02 - 0159 -

6、06摘要 :目的 探討類葉升麻苷對(duì)魚(yú)藤酮致多巴胺能神經(jīng)元SH2 SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 采用 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 ,以熒光染料 Hoechst33342染色分析細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化 ,用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡峰 ,以 2′ ,7′ 2 二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉 (DCFH2 DA )為標(biāo)記探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。結(jié)果 ①015μ mol·L- 1的魚(yú)藤酮處理 SH2 SY5Y細(xì)胞 48 h能

7、引起細(xì)胞存活率的顯著下降 ;誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡 ,凋亡率達(dá) 47139%;大部分細(xì)胞胞體皺縮 ,突起縮短消失或斷裂 ;染色質(zhì)皺縮、 濃縮、 斷裂及形成凋亡小體 ;細(xì)胞內(nèi)活性氧水平上升。② 預(yù)先用鹽生肉蓯蓉提取物類葉升麻苷 (10, 20或 40 mg·L- 1 )處理細(xì)胞 6 h, 可提高細(xì)胞存活率 ;明顯改善魚(yú)藤酮引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 ;流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率分別降低到 25187% , 23197% , 10145%;以DCF

8、H2 DA為標(biāo)記探針檢測(cè)到 20 mg·L- 1類葉升麻苷可明顯抑制魚(yú)藤酮引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生。 結(jié)論 類葉升麻苷能抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元 SH2 SY5Y細(xì)胞凋亡 ,其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用可能與降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平有關(guān)。關(guān)鍵詞 : 類葉升麻苷 ;魚(yú)藤酮 ;凋亡 ; SH2 SY5Y細(xì)胞 ;活性氧收稿日期 : 2005 - 09 - 12,修回日期 : 2005 - 11 - 18基金項(xiàng)目 : 國(guó) 家 重 點(diǎn) 基 礎(chǔ)

9、 研 究 發(fā) 展 計(jì) 劃 資 助 項(xiàng) 目 ( No2004CB519802) ; 國(guó) 家 自 然 科 學(xué) 基 金 資 助 項(xiàng) 目 ( No30472164)作者簡(jiǎn)介 :楊芳艷 ( 1980 - ) ,女 ,碩士生 , Tel: 0102 87474980, E2 mail:elin569@ sohu . com;蒲小平 (1956 - ) ,女 ,博士 ,教授 ,博士生導(dǎo)師 ,通訊作者 ,研究方向 :帕金森病與細(xì)胞凋亡相關(guān)的分子機(jī)制及藥

10、物的干 預(yù) 作 用 , Tel: 0102 82802431, Fax: 0102 82802431, E2mail: puxiaoping@263. net帕金森病 (Parkinsons D isease, PD)是第二大最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病 ,它能選擇性和進(jìn)行性地導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性和壞死 ,并且在中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的胞漿內(nèi)形成路易小體 (Lewy body) , 致使80%以上合成多巴胺的神經(jīng)元死亡 ,最終導(dǎo)致兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)

11、多巴胺的不足 ,并出現(xiàn) PD 特有的運(yùn)動(dòng)遲緩等癥狀。遺傳和環(huán)境因素在 PD 的發(fā)病中具有重要作用。神經(jīng)毒素如 12 甲基 2 42 苯基 2 1, 2, 3,62 四羥基吡啶 (12 methyl2 42 phenyl2 1, 2, 3, 62tetrahy2dropyridine, MPTP)或 62 羥基多巴胺 ( 62 hydroxydo2pam ine, 62 OHDA)制備的 PD 動(dòng)物模型已應(yīng)用了幾十年。然而 ,很少在 MP

12、TP和 62 OHDA制備的 PD動(dòng)物模型的中腦黑質(zhì)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn) Lewy body,它是PD發(fā)病后細(xì)胞漿內(nèi)特有的病理標(biāo)志物。魚(yú)藤酮是一個(gè)從魚(yú)藤屬植物中提取的具有生物活性的廣譜殺蟲(chóng)劑 ,也用于捕殺魚(yú)類。最近發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期暴露于魚(yú)藤酮的大鼠可以出現(xiàn)類似 PD 生物化學(xué)、 解剖學(xué)和行為學(xué)癥狀等各方面的特征。最重要的是魚(yú)藤酮能誘導(dǎo)中腦黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生類似于路易小體的胞漿內(nèi)涵體[ 1, 2 ] 。因此 ,有人認(rèn)為用魚(yú)藤酮制備的動(dòng)物模型是研究 PD最好

13、的動(dòng)物模型之一[ 3, 4 ] 。 同時(shí) ,用魚(yú)藤酮處理細(xì)胞制備的 PD 細(xì)胞模型國(guó)內(nèi)外也有報(bào)道[ 5 ] ,有關(guān)鹽生肉蓯蓉 (Cistanche salsa)的有效成分類葉升麻苷對(duì)該細(xì)胞模型的保護(hù)作用尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道。因此 ,本文就類葉升麻苷對(duì)魚(yú)藤酮致多巴胺能神經(jīng)元 SH2 SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用進(jìn)行了探討和研究。1 材料和方法· 9 5 1 · 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào) Chinese Phar m acologi

14、cal B ulletin 2006 Feb; 22 (2) : 159～64(20 mg·L- 1 )組、 類葉升麻苷 (20 mg·L- 1 )單獨(dú)處理組、 活性氧陽(yáng)性對(duì)照 (Rosup, 50 mg· L- 1 ,試劑盒提供 )組 1 × 106 細(xì)胞 ,懸浮于含 10μ mol·L- 1 2′ ,7′ 2 二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉 (DCFH2 DA ) 的無(wú)血清 DME M, 3

15、7 ℃, CO2 孵箱內(nèi)孵育 20 m in用無(wú)血清DME M洗 3次 ,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 DCFH2DA。Rosup的濃度和作用時(shí)間均按照活性氧檢測(cè)試劑盒要求 ,終濃度 50 mg·L- 1 ,刺激細(xì)胞時(shí)間 30m in,用 FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)定 DCF的平均熒光強(qiáng)度 ,激發(fā)光波長(zhǎng)為 488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為 525 nm,以各處理組 / 正常對(duì)照組的比值作為 ROS的數(shù)值。1. 2. 8 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、分析 所有結(jié)果以 ? x ± s表示 ,應(yīng)用 SPSS810軟件包 ,采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)分析處理數(shù)據(jù)。2 結(jié)果2. 1 類葉升麻苷對(duì)魚(yú)藤酮致 SH2 SY5Y細(xì)胞損傷的影響2. 1. 1 倒置顯微鏡下 SH2 SY5Y細(xì)胞的形態(tài)變化 正常對(duì)照組和類葉升麻苷單獨(dú)處理組 SH2 SY5Y細(xì)胞突起明顯 ,呈梭形、 不規(guī)則的三角形或多邊形。凋亡誘導(dǎo)組 SH2 SY5Y細(xì)胞大部分胞體皺縮 ,突起縮短消失或斷裂 ,細(xì)胞

17、呈圓形 ,而類葉升麻苷 (20 mg·L- 1 )組和 NGF (200 μg·L- 1 )組與凋亡誘導(dǎo)組比較 ,細(xì)胞胞體皺縮現(xiàn)象明顯改善 ,突起伸展 ,差異十分明顯 ( Fig 2)。2. 1. 2 Hoechst 33342核染色分析 正常對(duì)照組細(xì)胞的染色質(zhì)均勻分散于細(xì)胞核內(nèi)。凋亡誘導(dǎo)組可見(jiàn)部分細(xì)胞的染色質(zhì)出現(xiàn)典型凋亡樣改變 ,表現(xiàn)為染色質(zhì)呈月牙形聚集于核的一極 ,染色質(zhì)皺縮、 濃縮、斷裂、 形成凋亡小體 ;

18、而類葉升麻苷 (20 mg·L- 1 )組和 NGF組與凋亡誘導(dǎo)組比較 ,染色質(zhì)出現(xiàn)凋亡樣改變的細(xì)胞明顯減少 (Fig 3)。2. 1. 3 類葉升麻苷對(duì)魚(yú)藤酮致 SH2 SY5Y細(xì)胞存活率降低的影響 MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤酮作用 48 h后導(dǎo)致 SH2 SY5Y細(xì)胞的存活率下降到正常對(duì)照組細(xì)胞的 7717% ± 115%。類葉升麻苷單獨(dú)與細(xì)胞作用沒(méi)有引起毒性作用 ,而當(dāng)類葉升麻苷 (10, 20, 40mg

19、83;L- 1 )預(yù)處理 6 h后 ,發(fā)現(xiàn)它能明顯抑制魚(yú)藤酮所導(dǎo)致的細(xì)胞存活率的下降 ,并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性 ,細(xì)胞存活率由模型組的的 7717% ± 115%分別增加 到的 8815% ±111% , 9719% ±110% ,10513% ± 117% (Tab 1)。陽(yáng)性藥 NGF預(yù)處理 6 h,細(xì)胞存活率上升到 8310% ± 113%。以上結(jié)果表明 ,類葉升麻苷和 NGF可

20、明顯拮抗魚(yú)藤酮對(duì) SH2SY5Y細(xì)胞的毒性作用。Tab 1 Effect of acteoside on rotenone2i nduced decreasei n SH2 SY5Y cell vi ability ( ? x ± s, n = 4)Treat ment MTT/% of controlControl 100. 0 ± 1. 8Rotenone 77. 7 ± 1. 5##Rotenone

21、+ 200μg·L - 1 NGF 83. 0 ± 1. 33 3Rotenone + 10 mg·L - 1 acteoside 88. 5 ± 1. 13 3Rotenone + 20 mg·L - 1 acteoside 97. 9 ± 1. 03 3Rotenone + 40 mg·L - 1 acteoside 105. 3 ± 1. 73 340

22、 mg·L - 1 acteoside 101. 4 ± 4. 6## P < 0101 vs control; 3 3 P < 0101 vs rotenone2. 1. 4 類葉升麻苷對(duì)魚(yú)藤酮致 SH2 SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡時(shí) ,染色質(zhì) DNA降解、 斷裂成小分子量的片段并由細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散出去而使細(xì)胞內(nèi)DNA含量降低 ,在 G 1 期前面出現(xiàn)一個(gè) DNA含量減少的 G 1 亞峰 ( Su

23、b - G 1 peak) ,根據(jù)峰值的高低可以定量細(xì)胞凋亡的百分率。 PI染色法通過(guò)流式細(xì)胞儀可以檢測(cè) G 1 亞峰來(lái)定量細(xì)胞凋亡的百分率。類葉升麻苷單獨(dú)處理組細(xì)胞凋亡率為 5154% (Fig 4) ,與正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ,提示40 mg·L- 1類葉升麻苷不會(huì)誘導(dǎo) SH2 SY細(xì)胞凋亡。而 015μ mol·L- 1魚(yú)藤酮作用于 SH2 SY5Y細(xì)胞 48 h可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 ,凋亡率從 61

24、24% (正常對(duì)照組 )升到 47139%。預(yù)先加入類葉升麻苷 (10, 20或者 40mg ·L- 1 )或者 NGF6 h后可明顯抑制細(xì)胞凋亡的Fig 2 Protective effect of acteoside on rotenone2i nduced morphological change i n SH2 SY5Y cells( × 200)A: control; B: treat mentwith 0

25、15μ mol·L - 1 rotenone; C: treat mentwith 015μ mol·L - 1 rotenone and 20 mg·L - 1 acteoside; D: treat mentwith015μ mol·L - 1 rotenone and 200μg·L - 1 NGF; E: treat ment with 20 mg·L - 1 acte