20個(gè)測(cè)序常見的問(wèn)題

1、20 20個(gè)測(cè)序常見的問(wèn)題I. 為什么需要新鮮的菌液？首先，新鮮的菌液易于培養(yǎng)，可以獲得更多的DNA，同時(shí)最大限度地 保證菌種的純度。2.如何提供菌液？如果您提供新鮮菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以將培養(yǎng)好的 4 5ml菌液沉淀下來(lái)，倒去上清以方便郵寄。同時(shí)郵寄時(shí)最好用盒子以免郵寄過(guò)程中壓破。3. 如何制作穿刺菌？用滅菌過(guò)1.5ml或2ml離心管加入LB瓊脂(7g/L)斜面凝固，用接種針挑取分散良好的單菌 落穿過(guò)瓊 脂直達(dá)管底，不完全

2、蓋緊管蓋適當(dāng)溫度培養(yǎng)過(guò)夜，然后蓋緊蓋子加封口膜，室溫或4度保存。4. PCR PCR產(chǎn)物直接測(cè)序有什么要求？(1 )擴(kuò)增產(chǎn)物必須特異性擴(kuò)增，條帶單一。如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，一般難以得到 好的測(cè)序結(jié)果；(2 )必須進(jìn)行膠回收純化；(3) DNA純度在1.6—2.0之間，濃度50ng/ul以上。5. 為什么PCR PCR產(chǎn)物直接測(cè)序必須進(jìn)行Agarose Agarose膠純化？如果不進(jìn)行膠純化而直接用試劑盒回收，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致測(cè)序

3、出現(xiàn)雙峰甚至亂峰，這主要是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或者原來(lái)的PCR引物去除不干 凈所導(dǎo)致。大多所謂的 PCR “純化試劑盒”實(shí)際上只是回收產(chǎn)物而不能起到純化的作用的。對(duì)于非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物肯定無(wú)法去除，而且 通常他 們不能夠完全去除所有的PCR引物，這會(huì)造成殘留的引物在測(cè)序反應(yīng)過(guò)程中參與反應(yīng)而導(dǎo)致亂峰。6. 如何進(jìn)行PCR PCR產(chǎn)物純化？PCR產(chǎn)物首先必須用Agarose膠電泳，將特異擴(kuò)增的條帶切割下，然后純化。使用凝膠回收試劑盒 回收，產(chǎn)物用

4、ddH2O溶解。7. PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的好處？(1) PCR產(chǎn)物直接測(cè)序可以反映模板的真實(shí)情況；(2) 省去克隆的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用和時(shí)間；(3) PCR產(chǎn)物測(cè)序正確的片段進(jìn)行下一步克隆實(shí)驗(yàn)使結(jié)果更有保障；(4) 混合模板進(jìn)行PCR的產(chǎn)物直接測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)其中的點(diǎn)突變。8. 對(duì)用于測(cè)序的質(zhì)粒DNA的要求有哪些？對(duì)測(cè)序模板DNA的一般要求：(1)DNA純度要求高，1.6—2.0之間，不能有混合模板，也不能含 有RNA，染色體DNA，蛋白質(zhì)等；(2)

5、溶于ddH2O中，溶液不能含雜質(zhì)，如鹽類，或EDTA等 螯合劑，將干擾測(cè)序反應(yīng)正常進(jìn)行。9. 如何鑒定質(zhì)粒DNA濃度和純度？我們使用水平瓊脂糖凝膠電泳，并在膠中加入0.5ug/ml的EB(電泳緩沖液中不必加E,加一個(gè)已知 濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。電泳結(jié)束以后在紫外燈下比較亮度，判斷濃度和純度。此方法可以更直接、準(zhǔn)確 地判斷樣品中是否含有染色體DNA、RNA等，也可以鑒別抽提的質(zhì)粒DNA的不同構(gòu)型。質(zhì)粒DNA的3種構(gòu)型是指在抽提質(zhì)粒DNA過(guò)程中，

6、由于各種原因的影響，使得超螺旋的共價(jià) 閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒(SC)的一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀(0C)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成為線 狀(L)分子。這3種分子有不同的遷移率，通常，超螺旋型 (SC)遷移速度最快，其次為線狀(。分子，最慢為開環(huán)狀(0C )分子。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，或者用漠乙錠 -標(biāo)準(zhǔn)濃度DNA比較法只能檢測(cè)抽提到的產(chǎn)物中的濃度，甚至由于抽提的質(zhì)粒 DNA中含有RNA、蛋白質(zhì)、染色體DNA等因素的干擾，濃度檢測(cè)的數(shù)值也

7、是沒(méi)有多少意義的。10.為什么抽提的質(zhì)粒最好溶解在ddH2O中？出現(xiàn)這樣的情況只有兩種可能：(1)我們給您的測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)的不是您的樣品；(2)您的樣品插入部分與您預(yù)期的不一致。這時(shí)需要雙方將樣品進(jìn)行驗(yàn)證(PCR和酶切鑒定)。18. 樣品送測(cè)序前已經(jīng)鑒定過(guò)了，有插入片段的，為什么測(cè)序結(jié)果是一個(gè)空質(zhì)粒？測(cè)序是對(duì)樣品的 最好驗(yàn)證.結(jié)果為空載，可能如下：(1)可能在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生插入片段的丟失，由于這種情況的發(fā)生無(wú)法事先預(yù)期到；(2)提供的 克

8、隆是假陽(yáng)性克隆。19. 為什么到重復(fù)序列時(shí)(PloyA,T,C,G )后面信號(hào)幾乎都較亂？重復(fù)序列的測(cè)定是目前熒光測(cè)序 方法的一個(gè)局限。測(cè)序級(jí)的酶遇到連續(xù)的重復(fù)堿基的時(shí)候，對(duì)模板的判讀就會(huì)出現(xiàn)打滑現(xiàn)象，導(dǎo)致后 面的序列無(wú)法判讀。這樣的情況，建議反向測(cè)序。20. 全自動(dòng)熒光測(cè)序的準(zhǔn)確性如何？我們有兩種不同型號(hào)的測(cè)序儀：ABI377和ABI3730ABI377測(cè)序儀采用配套的Big DYE Terminator cycle sequenci

9、ng Kit,該測(cè)序方法以及安裝 儀器時(shí) 用標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試，準(zhǔn)確性達(dá)到一個(gè)反應(yīng) 500堿基中只有1個(gè)以下的錯(cuò)誤(即錯(cuò)誤率小于0.05%)。如果用戶得到一個(gè)測(cè)序結(jié)果的彩圖是清晰的，峰型是尖的，尖峰與讀取的堿基編碼是一 致的，那么它的準(zhǔn)確性應(yīng)該是可信的。當(dāng)然如果是新序列，最好用同方向或反方向再測(cè)序一次加以 驗(yàn)證。因?yàn)閮纱尾煌臏y(cè)序，同一個(gè)堿基上的錯(cuò)誤概率應(yīng)該小余0.0025%。同時(shí)出錯(cuò)的可能性極 小。ABI3730測(cè)序儀也是采用AB公司配套的