寡糖合成的新策略——固相酶法合成和ManNAc立體選擇性合成的研究.pdf

1、寡糖是生物體內(nèi)重要的生物分子，與核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子一樣在信號傳導，細胞間的識別與結合，細胞的生長與增殖，免疫應答和病原體的感染等過程中有著重要的作用。與蛋白質(zhì)和核酸這兩類生物大分子不同，寡糖的合成是非模板依賴型的合成。在這個過程中，不同糖基轉(zhuǎn)移酶和多種糖基供體構建了一個結構復雜的糖世界。近些年，隨著分子克隆技術的日漸成熟和對模式生物基因組的深入了解，酶促合成寡糖技術日漸成熟。因其高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性的特點，這種技術愈來愈被

2、人們重視。同時，在寡糖的酶法合成領域中，很多問題需要解決與改進。我們將這些問題歸納為“5S”。即:1.酶的特異性、2.底物的水溶性、3.制備稀有的底物與輔助因子、4.分離純化、5.規(guī)?；?。本文就是圍繞這5個問題開展課題的。本文的研究內(nèi)容主要有以下幾方面:
　　本文介紹了兩種利用固相技術簡化了寡糖酶法合成的分離過程。第一種方法是以pH敏感的水溶性線性高分子作為固相載體的化學酶法合成技術。這種載體有效的克服了固相載體影響酶與載體相互接

3、觸的問題。利用這種載體，本文使用一鍋三酶體系原位生成稀有糖基供體CMP-Sia，成功地合成了Sia-LN三糖衍生物。這種三糖衍生物在流感病毒侵染宿主過程中起著決定性的作用，是下游分子生物學及藥物開發(fā)研究中的重要研究對象。
　　基于第一種方法的優(yōu)點與不足，我們發(fā)展了第二代基于固相萃取技術的酶法合成策略。本策略的特點在于利用簡單的“標簽”技術無須任何前處理即可實現(xiàn)對酶法合成產(chǎn)物的純化。對比前人的研究，本方法有以下幾個優(yōu)點:1.使用的“

4、標簽”分子簡單易得，便于擴大規(guī)模;2.相較于傳統(tǒng)的固相載體，本方法反應速率更快，反應進程更容易監(jiān)控;3.本方法后處理過程中不需要傳統(tǒng)方法中的脫鹽，濃縮等操作，也不需要傳統(tǒng)固相萃取方法中的后期純化，縮短了分離純化過程所需時間。為了證實方法的可行性，本文共利用了6種糖基轉(zhuǎn)移酶合成了5種不同的具有重要生物學意義的寡糖分子。更重要的是，通過引入另外2種水解酶，本方法首次實現(xiàn)了在固定相上對目標化合物的純化，這一思路可以幫助未來人們設計出更加高效的

5、固相萃取策略。
　　為了更加高效地合成N-乙酰氨基甘露糖ManNAc及含有唾液酸的寡糖分子，本論文通過對底物扭張力的控制，首次報道了利用疊氮自由基對葡萄糖烯糖加成制備ManNAc衍生物的方法。通過高精度的計算，證實了本課題的設計思想及對反應機理的假設。首先扭張力在動力學控制的自由基立體選擇性加成過程中控制并決定了過渡態(tài)的選擇性，從而決定了產(chǎn)物的立體選擇性。其次，在熱力學控制的立體選擇性加成過程中，反應中心處扭轉(zhuǎn)角的構型決定了中間體

6、的選擇性，最終ManNAc的產(chǎn)物為最有利產(chǎn)物。最后通過對異頭碳自由基平均電離能的研究，不同取代基的電子效應決定了動力學控制和熱力學控制在產(chǎn)物選擇性中所占的比例。在有機方法學角度，本文展示了通過控制底物的扭轉(zhuǎn)角和取代基，可以實現(xiàn)對自由基活性的調(diào)節(jié)，從而實現(xiàn)對自由基反應路徑及立體選擇性的控制?；谖覀兊陌l(fā)現(xiàn)與技術，本文簡單高效地合成了ManNAc衍生物，并將其用于酶法合成了含有非天然唾液酸的三糖分子。此分子是重要的CD22的配體，可以用于B