PMA-qPCR定量檢測畜禽肉類中食源性致病菌活菌的研究.pdf

1、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是兩大食源性致病菌。在我國由沙門氏菌和金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件主要因食入了受污染的畜禽肉類食品為主。了解這兩類食源性致病菌在畜禽肉類食品中的污染程度，獲得其污染的定量數(shù)據(jù)，可為開展食品安全風險評估提供重要的科學依據(jù)。本研究旨在建立可快速、有效檢測沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的活菌定量檢測方法，并初步應用于畜禽肉類食品中此類菌檢測，為食品安全快速定量檢測提供技術(shù)支持。
　　疊氮丙啶（PMA）作為一種與核酸

2、具有親和性的光敏性染料，具有活/死細胞篩選的功能。它可通過死亡細胞的細胞膜，進入細胞內(nèi)，對胞內(nèi)的DNA進行不可逆修飾，使其不能進行擴增；而活細胞由于細胞膜完全阻止了PMA進入胞內(nèi)，因此活細胞的DNA擴增不受影響。PMA的選擇性功能與菌屬不同有關(guān)。本研究分別選取了革蘭氏陰性菌（沙門氏菌）和革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）各一株，分別分析了PMA對兩種菌活/死細胞的選擇性作用。對PMA作用的幾個關(guān)鍵因素，包括曝光時間、最小抑制濃度、最大毒性濃

3、度等進行了探索。通過實驗分析，確定5分鐘為適宜的曝光時間；沙門氏菌在PMA15μg/ml濃度下可完全抑制死菌DNA擴增，大于40μg/ml濃度時可對活菌產(chǎn)生影響；金黃色葡萄球菌 PMA的最小抑制濃度為30μg/ml，最大毒性濃度為50μg/ml。
　　本研究將PMA與qPCR相結(jié)合，建立PMA-qPCR定量檢測方法，更好地發(fā)揮了qPCR快速定量的功能，且利用PMA對活/死細胞具有選擇性的特性，規(guī)避常規(guī)qPCR方法和培養(yǎng)計數(shù)法中出現(xiàn)

4、假陽性和漏檢的情況，開發(fā)快速準確的活菌定量檢測技術(shù)。通過靈敏度和特異性分析評估PMA-qPCR方法的可靠性。PMA-qPCR方法最低可檢出101CFU/ml沙門氏菌或金黃色葡萄球菌。
　　本研究還設(shè)計構(gòu)建了針對沙門氏菌invA基因特定序列的質(zhì)粒標準品。用質(zhì)粒標準品建立的qPCR標準曲線最低可檢出10copies/reaction(R2=0.9979)。構(gòu)建了含有金黃色葡萄球菌nuc基因特定序列的質(zhì)粒作為金黃色葡萄球菌定量檢測方法的

5、標準品，所建立標準曲線R2為0.9973，可檢出14copies/reaction。質(zhì)粒的構(gòu)建為PMA-qPCR方法的穩(wěn)定性提供了保證。
　　本研究將PMA-qPCR活菌定量檢測方法應用于畜禽肉類食品樣本，通過對人工染菌的樣本進行分析，對畜禽肉類樣本中的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測范圍在103～108CFU/ml。與傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)法進行比較分析發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌活菌定量檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)法結(jié)果、金黃色葡萄球菌與紙片計數(shù)法結(jié)果均無統(tǒng)