aac(6’)-Ib-cr基因?qū)ΨZ酮類藥物耐藥的作用研究.pdf

1、質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥（PMQR）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種介導(dǎo)低水平喹諾酮類藥物耐藥的重要機(jī)制，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。PMQR基因在人源和畜禽源腸桿菌中檢出率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，尤其是同時(shí)介導(dǎo)氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物（FQs）耐藥的aac(6’)-Ib-cr基因在大腸桿菌和沙門菌的檢出率在不斷升高。然而，關(guān)于aac(6’)-Ib-cr基因在臨床廣泛流行的原因尚未見(jiàn)研究，該基因和其他的喹諾酮耐藥機(jī)制如靶位基因突變及外排泵等之間的相互關(guān)

2、系在國(guó)內(nèi)外也尚未見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)該基因的廣泛流行對(duì)菌株耐藥發(fā)展是否存在影響也不清楚。因此，本研究以畜禽源沙門菌為研究對(duì)象，分析了沙門菌中PMQR基因尤其是aac(6’)-Ib-cr基因的流行情況，靶位基因突變情況及它們與環(huán)丙沙星敏感性的關(guān)系，闡明了aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因與ESBLs基因的協(xié)同傳播機(jī)制，著重研究了aac(6’)-Ib-cr基因?qū)︵Z酮耐藥發(fā)展以及對(duì)流行的耐藥質(zhì)粒捕獲的影響，從而進(jìn)一步闡述了PMQR尤其是aa

3、c(6’)-Ib-cr介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥機(jī)制，為防控畜禽源沙門菌多重耐藥的產(chǎn)生和傳播提供理論依據(jù)。
　　1.畜禽源沙門菌中PMQR基因的流行及其與環(huán)丙沙星耐藥性的關(guān)系
　　本研究2014年從我國(guó)不同省或市的多個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)和雞場(chǎng)分離到159株沙門菌，采用玻片凝集法對(duì)所有菌株進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示159株沙門菌共有3種血清型：鼠傷寒(n=95)，印第安納(n=63)和腸炎(n=1);采用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定了菌株對(duì)獸醫(yī)臨床常用

4、的6類抗生素的的敏感性，結(jié)果顯示畜禽源沙門菌的耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，對(duì)四環(huán)素，氨芐西林，鏈霉素和慶大霉素的耐藥率都超過(guò)了80％，對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率超過(guò)了60%，對(duì)頭孢噻肟和動(dòng)物專用藥頭孢噻呋的耐藥率也在50%左右，且全部為多重耐藥。采用PCR及測(cè)序的方法檢測(cè)PMQR基因的流行情況和靶位基因QRDR的突變情況，并分析PMQR,靶位基因突變以及喹諾酮MIC之間的關(guān)系。結(jié)果表明，90.6%的沙門菌至少攜帶一種PMQR基因，其中以oqxAB(

5、78%)和aac(6’)-Ib-cr(69%)最為常見(jiàn)并且兩者多共存于同一菌株中。85.5%的菌株發(fā)生靶位基因的突變，以gyrAD87N單突變和gyrA:S83F D87G+ parC:T57S S80R突變組合最為流行，91.8%的aac(6’)-Ib-cr基因陽(yáng)性菌中檢測(cè)到靶位基因的突變，其中54.5%的突變是gyrAD87N單突變。aac(6’)-Ib-cr+oqxAB或aac(6’)-Ib-cr+oqxAB+qnr共存的菌株對(duì)環(huán)

6、丙沙星的耐藥率分別為72.1%和95.5%，且多表現(xiàn)為對(duì)喹諾酮類藥物較高水平耐藥（MIC≥16mg/L）。在有aac(6’)-Ib-cr+oqxAB基因存在的菌株中，僅gyrAD87N單突變存在時(shí)環(huán)丙沙星的MIC≥16mg/L，耐藥水平與多突變的菌株差別不大，說(shuō)明在這種菌株中環(huán)丙沙星的耐藥水平與突變的個(gè)數(shù)不呈正相關(guān)。因此在畜禽源沙門菌中aac(6’)-Ib-cr基因流行較高，且常與oqxAB基因及gyrAD87N單突變共存于同一菌株中，

7、對(duì)環(huán)丙沙星的高水平耐藥起著重要作用。
　　2.aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB陽(yáng)性菌株中ESBLs基因的流行及傳播機(jī)制研究
　　用PCR和測(cè)序方法對(duì)aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB陽(yáng)性菌株中ESBLs基因的流行情況進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果表明在144株aac(6’)-Ib-cr和/或 oqxAB陽(yáng)性菌株有45株檢測(cè)到ESBLs基因,全部為blaCTX-M-9G基因,檢出率為31.3%,共有三種亞型,最為流行的是bl

8、aCTX-M-27(n=34),其次為blaCTX-M-65(n=7)和blaCTX-M-14(n=4)。45株blaCTX-M陽(yáng)性菌株中有35株攜帶oqxAB基因，31株攜帶aac(6’)-Ib-cr基因。采用PFGE,接合轉(zhuǎn)移/電擊轉(zhuǎn)化和S1-PFGE、Southern雜交對(duì)aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB和blaCTX-M基因的協(xié)同傳播機(jī)制進(jìn)行了研究。PFGE結(jié)果顯示這些陽(yáng)性菌株中存在克隆傳播，從而促進(jìn)了aac(6’)-

9、Ib-cr和/或oqxAB-blaCTX-M基因的垂直傳播；接合轉(zhuǎn)移/電擊轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示45株blaCTX-M陽(yáng)性菌株中有38株發(fā)生轉(zhuǎn)移,且68.4%的陽(yáng)性菌株發(fā)生aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB共轉(zhuǎn)移。對(duì)質(zhì)粒特征分析結(jié)果表明質(zhì)粒大小在80~280kb之間，共檢測(cè)到5種不同的質(zhì)粒復(fù)制子類型，14株攜帶blaCTX-M-27接合子/轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒是不可分型的。結(jié)果表明菌株的克隆傳播以及耐藥質(zhì)粒（P-like質(zhì)粒）的水平傳播是導(dǎo)致bl

10、aCTX-M基因和aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB基因協(xié)同傳播的重要原因。
　　3.aac(6’)-Ib-cr基因?qū)︵Z酮類藥物耐藥的影響
　　將aac(6’)-Ib-cr基因克隆到質(zhì)粒載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入到J53,DH5α以及實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株SL1344和野生株 SH10的外排泵缺失菌中，測(cè)定菌株的MIC、MPC及適應(yīng)性，并用濃度遞增法誘導(dǎo)菌株耐藥，研究aac(6’)-Ib-cr基因?qū)Ψ?/p>

11、諾酮耐藥以及耐藥發(fā)展的影響。結(jié)果表明導(dǎo)入攜帶 aac(6')-Ib-cr基因的重組質(zhì)?？梢允咕陮?duì)環(huán)丙沙星的MIC升高2~4倍，MPC增加8~16倍，同時(shí)使菌株在共培養(yǎng)時(shí)具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。在耐藥發(fā)展過(guò)程中，在J53及DH5α導(dǎo)入攜帶aac(6')-Ib-cr基因的重組質(zhì)粒時(shí)，并不促進(jìn)喹諾酮類藥物作用靶位的突變，但增加菌株的突變頻率；另外，在加入外排泵抑制劑后,環(huán)丙沙星的MIC顯著降低，可達(dá)32~267倍，顯著高于無(wú)aac(6')-Ib-cr

12、基因的菌株。而在SL1344和SH10菌株中，敲除AcrAB-TolC外排泵,不利于菌株的生長(zhǎng)和導(dǎo)入重組質(zhì)粒，在獲得aac(6')-Ib-cr重組質(zhì)粒的外排泵缺失株的耐藥發(fā)展過(guò)程中，發(fā)現(xiàn) aac(6')-Ib-cr可協(xié)同靶位基因以及其他的外排泵提高菌株向高水平耐藥發(fā)展的能力。因此，aac(6')-Ib-cr基因不僅降低菌株對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性，提高菌株的防突變濃度，增強(qiáng)菌株的競(jìng)爭(zhēng)能力，而且在喹諾酮類藥物耐藥發(fā)展過(guò)程中增加突變頻率，與外

13、排泵機(jī)制共同加速高水平耐藥菌株的篩選。
　　4.質(zhì)粒全測(cè)序以及aac(6’)-Ib-cr基因?qū)|(zhì)粒的影響初探
　　為進(jìn)一步研究aac(6’)-Ib-cr基因存在時(shí)，對(duì)菌株捕獲其他耐藥質(zhì)粒的影響，對(duì)上述研究中較為流行的攜帶blaCTX-M-27基因的不可分型的質(zhì)粒采用高通量測(cè)序?qū)ζ浜怂崛蛄薪Y(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表明攜帶blaCTX-M-27的pSC15質(zhì)粒大小為103.44kb，是一個(gè)P-like（類噬菌體）質(zhì)粒,與噬菌體

14、P7相似度達(dá)73%，質(zhì)粒上含有大量的噬菌體基因。將pSC15導(dǎo)入到有/無(wú)aac(6’)-Ib-cr的菌株中,結(jié)果表明在aac(6')-Ib-cr存在時(shí)，菌株容易捕獲P-like質(zhì)粒pSC15，aac(6')-Ib-cr可以補(bǔ)償pSC15的適應(yīng)性代償，使菌株的生長(zhǎng)能力提高，競(jìng)爭(zhēng)能力增強(qiáng)。該基因的存在可能有利于菌株捕獲其他的耐藥質(zhì)粒并且提高菌株捕獲其他質(zhì)粒后的競(jìng)爭(zhēng)能力，這在一定程度上可以解釋臨床上aac(6')-Ib-cr基因廣泛流行且一般