表面展示生物合成α-熊果苷的研究.pdf

1、α-熊果苷作為一種安全無毒的美白制劑廣泛添加于各類化妝品中，其生產(chǎn)方式主要靠酶催化合成，但酶合成有諸多不足。本課題嘗試將表面展示系統(tǒng)與酶相結(jié)合，從本實(shí)驗(yàn)篩選出的嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonas MaltopHilia BT-112)中擴(kuò)增出能催化合成α-熊果苷的葡糖基轉(zhuǎn)移酶XgtA基因，與冰核蛋白Inak進(jìn)行N端融合將葡糖基轉(zhuǎn)移酶XgtA展示在細(xì)菌表面。將構(gòu)建出的基因工程菌通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后再通過SDS-PAGE分析，該蛋白在

2、大腸桿菌中能正確表達(dá)，且為可溶性蛋白，再利用帶有熒光標(biāo)簽的抗體與融合蛋白末端帶有的組氨酸標(biāo)簽結(jié)合，通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀證實(shí)了XgtA被展示在細(xì)胞表面。
　　本課題對誘導(dǎo)條件進(jìn)行初步優(yōu)化，得到了最適誘導(dǎo)溫度為15℃，誘導(dǎo)時(shí)間為24h，最適IPTG濃度為0.4mmol·L-1。由于對苯二酚存在底物抑制效應(yīng)，所以本實(shí)驗(yàn)還從提高菌體自身耐受度著手，通過梯度平板篩選將能夠耐受低濃度對苯二酚的菌株篩選出來，并接著利用點(diǎn)種法將初篩菌株進(jìn)行

3、復(fù)篩，最終得到了最大耐受濃度為4％（對苯二酚364mmol·L-1）的菌株。
　　本課題將構(gòu)建的重組菌BL21-P-I-X進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，初步確定了催化反應(yīng)結(jié)束時(shí)間為72h，底物為麥芽糖，反應(yīng)溫度為25℃，pH值為7，對苯二酚與麥芽糖的摩爾比為1∶10，且初始添加對苯二酚濃度為150mmol·L-1。在全細(xì)胞催化中人工添加抗氧化劑（抗壞血酸），和黃原膠均能減少對苯二酚對菌體的氧化作用，當(dāng)添加抗壞血酸為5mmol·L-1時(shí)，α-