HPA1-28w基因分型方法的研究和血小板供者基因庫的建立及應用.pdf

1、目的：
　　建立血小板同種抗原（HPA1-28w）系統(tǒng)測序分型技術(PCR-SBT)基因診斷方法，并建立無償獻血者血小板HPA、HLA-A、B基因數(shù)據(jù)庫，評估HPA1-28w系統(tǒng)錯配的概率。利用建立的血小板基因型數(shù)據(jù)庫，為血小板輸注無效患者選擇基因“數(shù)字化”配合的供者，為有效解決血小板輸注無效提供一種可行的方法，進一步提高臨床輸血安全。
　　方法：
　　1.采用商用基因組DNA抽提試劑盒，利用自動抽提設備對樣本基因組D

2、NA進行抽提。樣本來自隨機的1060例單采血小板獻血者，征其知情同意后采集全血標本。
　　2.從歐洲免疫多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(the Immuno Polymorphism Database，IPD：www.ebi.ac.uk/ipd/hpa)中下載HPA1-28w所在基因的核酸序列信息及各HPA相關的核苷酸多態(tài)性位點，利用Primer3.0(v.0.4.0)軟件設計引物，優(yōu)化PCR參數(shù)，實現(xiàn)同一擴增條件下擴增HPA1-28w系統(tǒng)。然后采

3、用商用試劑（ABI Bigdye3.1）參照試劑說明進行測序反應，利用ABI SeqScape V2.5軟件進行HPA序列比對分析。
　　3.采用商用試劑進行HLA-A,B位點基因分型，參照試劑說明進行操作。采用Assign3.5 SBT分析軟件確定標本HLA等位基因，HLA-A,B位點等位基因頻率采用直接計數(shù)法計算，單體型頻率及 Hardy–Weinberg遺傳平衡檢驗均采用Arlequin軟件分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計

4、學意義。
　　4.采用單克隆抗體特異的血小板抗原固定試驗（MAIPA）方法檢測PTR患者HPA抗體和HLA抗體。按照交叉反應組（CREGs）配合技術在血小板供者數(shù)據(jù)庫選擇供者，配型分級按照美國AABB血小板HLA配型分級標準。
　　5.HPA等位基因頻率采用直接計數(shù)法計算，Hardy–Weinberg遺傳平衡檢驗采用SPSS13.0軟件，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。HPA抗原不配合概率的計算公式為a抗原不配合概率=b

5、2(1-b2)，b抗原不配合概率=a2(1-a2)；HPA抗原隨機輸注不配合概率=a2(1-a2)+b2(1-b2)。
　　結果：
　　1.建立了HPA1-28w系統(tǒng)的PCR-SBT基因分型方法，所有HPA系統(tǒng)在同一條件下實現(xiàn)多重PCR擴增。多重PCR擴增后每組均能得到明顯的三個條帶，且三個條帶均呈現(xiàn)一定的強度，擴增產(chǎn)物片段長度在272bp到695bp之間，與預期大小一致。除HPA-5系統(tǒng)反向引物測序時會出現(xiàn)多態(tài)性位點后續(xù)堿

6、基峰雜亂外，其他HPA抗原系統(tǒng)正反兩向引物測序均得到明顯清楚的結果。檢測國際輸血協(xié)會血小板免疫學Workshop的10份考核樣本，分型結果與提供的參考結果完全一致。
　　2.在檢測的1060例樣本中，HPA-1、2、3、4、5、6w、15、21w系統(tǒng)存在多態(tài)性，其他HPA系統(tǒng)只檢測出HPA-aa基因型。其中HPA-1系統(tǒng)a頻率為0.9948，b頻率為0.0052；HPA-2系統(tǒng)a頻率為0.9410，b頻率為0.0590；HPA-3

7、系統(tǒng)a頻率為0.5316，b頻率為0.4684；HPA-4系統(tǒng)a頻率為0.9981，b頻率為0.0019；HPA-5系統(tǒng)a頻率為0.9882，b頻率為0.0118；HPA-6w系統(tǒng)a頻率為0.9835，b頻率為0.0165；HPA-15系統(tǒng)a頻率為0.5330，b頻率為0.4670；HPA-21w系統(tǒng)a頻率為0.9915，b頻率為0.0085。
　　3.HPA-1、2、3、4、5、6w、15、21w系統(tǒng)錯配的概率分別為0.0102

8、7，0.10481，0.37400，0.00376，0.02304，0.03195，0.37391，0.01670。在不考慮ABO血型的情況，理論上出現(xiàn)一個HPA-1系統(tǒng)bb純合子，需要37144例供者。出現(xiàn)一個HPA-4系統(tǒng)bb純合子，需要280900例供者。出現(xiàn)一個HPA-5系統(tǒng)bb純合子，需要7191例供者。出現(xiàn)一個HPA-6w系統(tǒng)bb純合子，需要3669例供者。出現(xiàn)一個HPA-21w系統(tǒng)bb純合子，需要13872例供者。

9、　　4.分析顯示1060例樣本中HLA-A,B位點分布符合Hardy-Weinberg平衡分析。HLA-A觀察雜合度為0.87736，預期雜合度為0.88486，P值為0.14095；HLA-B觀察雜合度為0.93774，預期雜合度為0.94668，P值為0.22917。HLA-A等位基因頻率最高為A*11:01，大于1％的等位基因有A*24:02、A*02:01、A*02:07、A*33:03、A*26:01、A*02:03、A*02

10、:06、A*03:01、A*11:02、A*31:01、A*30:01、A*01:01，累計頻率達到95.85%。HLA-B等位基因頻率最高為B*46:01，大于1%的等位基因有B*40:01、B*58:01、B*07:02、B*13:01、B*13:02、B*15:01、B*15:02、B*15:11、B*39:01、B*40:02、B*40:06、B*15:18、B*48:01、B*44:03、B*51:01、B*27:04、B*3

11、5:01、B*37:01、B*38:02、B*55:02、B*54:01、B*52:01、B*15:27，累計頻率達到89.48%。
　　5.按照HLA抗原交叉反應組進行分類：1C組為38.0660%；2C組為57.1699%；4C組為53.2075%；5C組為40.4719%；6C為49.9527%；7C為41.5565%；8C組為7.4527%；10C組為13.5378%；12C組為30.1414%。按照B1X配合度，估算患者

12、（8C組患者）至少搜尋到1個B1X配合級供者時，理論上需要32414個供者。
　　6.用MAIPA方法分析32例血小板輸注無效標本，其中26例檢測出HLA抗體，1例同時檢出HLA抗體和抗HPA-15抗體。對9例申請數(shù)據(jù)庫搜尋血小板供者的PTR患者利用基因“數(shù)字化”數(shù)據(jù)配合技術進行血小板供者篩選，其中4例篩選到A級匹配供者、2例篩選到B1U級供者、2例篩選到B1X級供者，篩選的血小板輸注后臨床癥狀改善明顯，止血效果良好。
　　

13、結論：
　　1.建立了同一擴增體系條件下血小板同種抗原系統(tǒng)HPA1-28w基因測序診斷技術，方法準確有效。
　　2.建立了1060例浙江漢族已知基因型的血小板供者數(shù)據(jù)庫。
　　3.發(fā)現(xiàn)人群中HPA-1、2、3、4、5、6w、15、21w系統(tǒng)存在多態(tài)性，其他系統(tǒng)呈現(xiàn)單一型，首次獲取了人群HPA22w-28w等位基因頻率,評估了HPA1-28w系統(tǒng)隨機輸注時抗原錯配的概率。
　　4.獲取了浙江漢族人群HLA-A、HL