藁本內(nèi)酯經(jīng)抑制自噬干擾DNA損傷修復(fù)機制恢復(fù)耐他莫昔芬乳腺癌細(xì)胞的敏感性.pdf

1、目的：他莫昔芬對ERα陽性的乳腺癌患者有良好的治療效果，但是耐藥性的出現(xiàn)限制其效果和應(yīng)用。目前認(rèn)為細(xì)胞自噬可能為導(dǎo)致他莫昔芬耐藥性的關(guān)鍵機制之一，但此種保護性自噬形成的具體分子機制及如何促使他莫昔芬產(chǎn)生耐藥性尚未闡明。藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸、川芎中的主要活性成分之一，在目前的研究中，僅有一篇文獻指出藁本內(nèi)酯能調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，它對自噬的具體作用并未做探究，且藁本內(nèi)酯能否恢復(fù)耐藥ERα陽性乳腺癌細(xì)胞的他莫昔芬敏感性也還未見報道。本研究

2、擬首先闡明他莫昔芬耐藥性產(chǎn)生過程中保護性自噬形成的機制，并且明確保護性自噬對DNA損傷修護機制的影響，進而揭示他莫昔芬耐藥性產(chǎn)生的機制。同時，以藁本內(nèi)酯為研究對象，對其抑制自噬及DNA損傷修護機制和恢復(fù)耐-他莫昔芬的ERα陽性乳腺癌細(xì)胞的敏感性進行了初步探索。
　　方法：采用高濃度短時間他莫昔芬沖擊法誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性。在表征敏感株與耐藥株之間的區(qū)別方面：以磺酰羅丹明B法檢測他莫昔芬對敏感株和耐藥株細(xì)胞存活率的影響。再以GFP

3、-LC3觀察敏感株和耐藥株中基礎(chǔ)自噬水平的差別；采用Western blotting檢測相關(guān)蛋白的表達輔以驗證。隨后加入自噬抑制劑氯喹探討耐藥株中的自噬是否對其存活有保護作用。最后用免疫共沉淀的方法探討耐藥株中自噬水平升高的分子機制。在考察藁本內(nèi)酯對細(xì)胞自噬的調(diào)控作用及其分子機制方面：首先RFP-LC3和Western blotting檢測藁本內(nèi)酯對細(xì)胞自噬的調(diào)控作用；加入氯喹聯(lián)合處理輔以驗證。后以tf-mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒、G

4、FP-LC3&RFP-LAMP1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染、檢測組織蛋白酶D的表達和溶酶體的pH等實驗確定藁本內(nèi)酯調(diào)控自噬的機制。在考察藁本內(nèi)酯恢復(fù)耐藥乳腺癌細(xì)胞的他莫昔芬敏感性方面：首先以磺酰羅丹明B法檢測藁本內(nèi)酯單獨或聯(lián)合他莫昔芬對耐藥乳腺癌細(xì)胞存活率的影響，同時以克隆形成實驗和Hoechst33342染色輔以驗證。再檢測PARP的表達以及泛Caspase抑制劑（Z-VAD-FMK）對細(xì)胞存活率的恢復(fù)作用，考察藁本內(nèi)酯恢復(fù)他莫昔芬細(xì)胞毒性是否通過

5、Caspase途徑。在考察DNA損傷及藁本內(nèi)酯是否干擾DNA損傷修復(fù)機制方面：首先考察DNA損傷相關(guān)蛋白的表達情況，進一步地采用shRNA抑制Nur77的表達后，考察是否Nur77對耐藥株DNA損傷水平和細(xì)胞存活率有影響。接下來加入泛素化抑制劑MG132、siRNA抑制Beclin1、藁本內(nèi)酯、氯喹處理細(xì)胞，通過Western blotting檢測Nur77能否被恢復(fù)表達。最后通過免疫共沉淀和DNA親和沉淀實驗（DAPA）法探討藁本內(nèi)酯

6、如何通過Nur77干擾DNA損傷修復(fù)途徑的機制。
　　結(jié)果：對比MCF-7和T-47D細(xì)胞，MCF-7TR5和T-47DTR5細(xì)胞對~5μM的他莫昔芬表現(xiàn)出良好的耐受性。GFP-LC3質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染后，比之MCF-7細(xì)胞，MCF-7TR5細(xì)胞中觀察到綠色點狀熒光聚集，自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II/I、p62蛋白的表達下降，且BRCA1、Nur77等蛋白表達也降低；而通過氯喹抑制自噬后能明顯增強他莫昔芬的細(xì)胞毒性；最后，免疫共沉淀實驗結(jié)果表

7、明Beclin1-PI3KC3-ATG14復(fù)合物結(jié)合增加。mRFP-LC3質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MCF-7TR5細(xì)胞后，藁本內(nèi)酯能明顯增加細(xì)胞內(nèi)紅色點狀熒光聚集；進一步的Western blotting結(jié)果表明藁本內(nèi)酯以時間-和劑量-依賴性方式增加LC3-II/I和p62的表達，與氯喹類似。隨后tf-mRFP-GPF-LC3轉(zhuǎn)染MCF-7TR5細(xì)胞后，藁本內(nèi)酯和氯喹誘導(dǎo)MCF-7TR5細(xì)胞中黃色熒光增加；GFP-LC3和RFP-LAMP1共同轉(zhuǎn)染

8、MCF-7TR5細(xì)胞，藁本內(nèi)酯導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)黃色熒光減少，二者均表明自噬-溶酶體融合受阻。進一步地實驗結(jié)果表明藁本內(nèi)酯能下調(diào)組織蛋白酶D的表達，并中和溶酶體pH。藁本內(nèi)酯聯(lián)合他莫昔芬處理耐藥乳腺癌細(xì)胞后，實驗表明聯(lián)合給藥能夠增加耐藥乳腺癌細(xì)胞的凋亡，降低耐藥乳腺癌細(xì)胞存活率及細(xì)胞集落的形成。然而活化的PARP表達沒有變化；與之相符合的是泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK也不能恢復(fù)聯(lián)合給藥下調(diào)的細(xì)胞存活率。對比MCF-7細(xì)胞，MCF-7

9、TR5細(xì)胞中BRCA1、RAD51表達下降，表明DNA損傷修復(fù)的同源重組修復(fù)途徑受損，而Ku80表達上升，則DNA損傷修復(fù)的非同源性末端接合機制啟動。實驗結(jié)果表明MCF-7TR5細(xì)胞中γ-H2AX的表達高于MCF-7細(xì)胞；隨后對比單獨的他莫昔芬，藁本內(nèi)酯聯(lián)合他莫昔芬能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的表達。sh-RNA法抑制細(xì)胞內(nèi)Nur77的表達后，聯(lián)合給藥導(dǎo)致的γ-H2AX表達積累和下調(diào)MCF-7TR5細(xì)胞存活率的作用被逆轉(zhuǎn)。隨后，MG132、

10、siRNA抑制Beclin1、氯喹和藁本內(nèi)酯分別處理細(xì)胞后，結(jié)果表明只有抑制自噬能夠恢復(fù)Nur77的表達。接下來，免疫共沉淀法證實在MCF-7TR5細(xì)胞中，Nur77與Ku80的相互作用減弱，但藁本內(nèi)酯能夠增強二者的相互作用；最后DNA親和沉淀實驗證實藁本內(nèi)酯能夠抑制Ku80和DNA-PKcs分別與DNA-末端的結(jié)合作用。
　　結(jié)論：隨著他莫昔芬的治療，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)Beclin1與Bcl2的結(jié)合減弱，釋放出Beclin1，導(dǎo)致Be

11、clin1-PI3KC3-ATG14復(fù)合物結(jié)合增加，自噬水平上升，產(chǎn)生耐藥性促進癌細(xì)胞存活。此外，由于BRCA1和RAD51表達的下降， Ku80表達的升高，MCF-7TR5細(xì)胞出現(xiàn)更高的DNA損傷水平。有趣的是，耐藥株中過高的細(xì)胞自噬導(dǎo)致Nur77的表達降低，使其與Ku80形成的復(fù)合物降低，導(dǎo)致非同源重組修復(fù)水平升高。在細(xì)胞自噬方面，藁本內(nèi)酯通過干擾自噬體與溶酶體的融合和影響溶酶體功能抑制自噬。更重要的是，藁本內(nèi)酯抑制自噬恢復(fù)MCF-