納米炭淋巴結(jié)示蹤在直腸癌中的運用及新型藥物納米載體的制備與作用研究.pdf

1、直腸癌是目前人類最高發(fā)的惡性腫瘤之一，手術(shù)治療一直是最有效的治療手段。根據(jù)目前的TNM腫瘤分期標準，術(shù)后準確的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對于患者病理分期及后期治療和隨訪計劃指定有著重要的重要指導意義。為了得到準確的區(qū)域淋巴結(jié)評價，目前美國的NCCN指南要求在結(jié)直腸癌術(shù)后標本中必須獲取12-14枚淋巴結(jié)。還有一些研究認為從手術(shù)標本中獲取更多的淋巴結(jié)對于術(shù)后準確的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后評估更有利。
　　新輔助放化療后進行根治性直腸前切除是目前N

2、CCN指南推薦的局部進展期直腸癌的標準治療方案。大量的研究表明這種方案可以增加術(shù)中腫瘤切除率及保留肛門括約肌的比例，也可以降低術(shù)后局部復發(fā)率。然而目前大量的研究證明新輔助放化療后直腸癌手術(shù)標本中獲取的淋巴結(jié)術(shù)后會顯著減少。雖然針對新輔助放化療后這一類患者來說，從標本中獲取淋巴結(jié)數(shù)目減少對于患者預后評價的影響還有爭議，但也有一些觀察性研究表明，在這一類患者中，區(qū)域淋巴結(jié)陽性患者的標本淋巴結(jié)獲取數(shù)量明顯多于區(qū)域淋巴結(jié)陰性患者。這就預示著提高

3、這一類患者術(shù)后標本中淋巴結(jié)檢出數(shù)目，有可能可以提高癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的發(fā)現(xiàn)率，從而獲得更加準確的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，以指導術(shù)后治療及隨訪計劃的制定，為患者帶來更大的獲益。
　　在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍粘膜下注射納米炭混選注射液可以提高胃腸癌手術(shù)標本中淋巴結(jié)獲取數(shù)目，而不增加手術(shù)時間和標本處理時間。為了進一步評價新輔助放化療后直腸癌患者術(shù)后標本中淋巴結(jié)獲取數(shù)目和陽性癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)率之間的關(guān)系，并且評價納米炭混懸注射液在提高該類患

4、者淋巴結(jié)檢出數(shù)目中的作用，我們從2013年8月開始對新輔助放化療直腸癌患者運用了這項技術(shù)。
　　雖然納米炭等淋巴結(jié)示蹤劑可以特異性識別淋巴結(jié)，顯著術(shù)者術(shù)中、術(shù)后標本淋巴結(jié)的識別能力。但目前臨床上使用所有淋巴結(jié)示蹤劑均不具備腫瘤特異性，無法再術(shù)中實時辨別轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。這使得淋巴結(jié)示蹤劑的使用受到了很大的限制。
　　因此，我們計劃合成新型的納米材料，預期使其既要有特異性的淋巴結(jié)示蹤功能，也要可以卸載可特異性識別腫瘤細胞的熒光材料，

5、以達到術(shù)中實時辨認癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的作用。為達到此目的，我們設(shè)計了結(jié)合氧化鐵納米簇和葡聚糖的新型可攜載納米淋巴結(jié)示蹤材料(DIONs)。該納米材料的大小限制在100-200nm之間，這使得它可以像納米炭一樣通過淋巴管內(nèi)皮細胞之間的間隙進入淋巴管而特異性進入淋巴結(jié)中，使淋巴結(jié)顯現(xiàn)出鐵離子的黑褐色。并且因為在納米簇上修飾合成了葡聚糖，而使納米簇具有大量的羥基結(jié)構(gòu)。這些羥基結(jié)構(gòu)可以通過共軛效應鏈接可以識別腫瘤細胞的熒光藥物。在特異性進入淋巴結(jié)后，

6、在癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的酸性環(huán)境下大量釋放藥物，產(chǎn)生遠大于正常的自體熒光，以達到鑒別癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的作用。本研究就在于研究合成的DIONs的方法及其淋巴結(jié)示蹤效果和生物安全性，為后期鏈接腫瘤特異性熒光藥物做基礎(chǔ)。
　　第一部分 術(shù)前粘膜下注射納米炭對于提高新輔助直腸癌患者淋巴結(jié)病理分期的作用研究
　　目的：分析新輔助放化療后直腸癌患者淋巴結(jié)檢出數(shù)目和淋巴結(jié)病理分期之間的關(guān)系。并評價納米炭混選注射液在提高新輔助放化療后直腸癌患者淋巴結(jié)檢

7、出數(shù)目及準確淋巴結(jié)病理分期的作用。
　　方法：從2008年9月到2014年7月，152名連續(xù)的局部進展期直腸癌患者接受新輔助放化療后根治性切除手術(shù)，其中45例患者術(shù)前經(jīng)肛行納米炭混懸液腫瘤周圍粘膜下注射。分析所有患者術(shù)后淋巴結(jié)檢出數(shù)目和癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)率之間的關(guān)系，并分析注射納米炭患者和未注射納米炭患者之間淋巴結(jié)檢出數(shù)目和淋巴結(jié)病理分期之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：在淋巴結(jié)檢出1-5枚的患者中，術(shù)后淋巴結(jié)陽性比例8.6％，明顯低于

8、淋巴結(jié)檢出數(shù)目17-44枚的37.8％。多因素分析顯示淋巴結(jié)檢出數(shù)目是淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)率的獨立危險因素(p=0.036)。納米炭組患者術(shù)后淋巴結(jié)檢出數(shù)目明顯高于對照組患者(21.1 vs8.0，p=0.000)。對照組術(shù)后淋巴結(jié)陽性患者比率明顯少于納米炭組(19.6％ vs35.6％，p=0.037)。在納米炭組中發(fā)現(xiàn)的58枚癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，45枚(77.6％)被黑染。在37枚小于5mm的癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中33枚(89.2％)被黑染。

9、>　　結(jié)論：使用納米炭等淋巴結(jié)示蹤劑可以提高新輔助放化療后直腸癌患者術(shù)后淋巴結(jié)檢出數(shù)目，并且得到更加準確的淋巴結(jié)病理分期。
　　第二部分 葡聚糖修飾納米氧化鐵分散液的制備及淋巴結(jié)示蹤的作用和生物安全性研究
　　目的：本研究的目的在于制備和表征可攜載藥物的葡聚糖修飾納米氧化鐵分散液(DIONs)，評價其淋巴結(jié)示蹤功能及生物安全性。
　　方法：我們利用三價鐵、二價鐵與右旋糖干經(jīng)化學共沉淀得到DIONs并表征其理化性質(zhì)。將合

10、成的DIONs于大鼠胃壁漿膜下注射，觀察DIONs的區(qū)域淋巴結(jié)示蹤功能。并通過DIONs與人淋巴細胞共培養(yǎng)及CCK-8法評價其體外細胞生物安全性。通過觀察大鼠注射后三個月內(nèi)不同時期肝腎功能及腹腔情況，了解DIONs的體內(nèi)生物安全性。通過DIONs攜載Cy5熒光以及對示蹤大鼠的解剖，了解DIONs在心、腦、肝、肺、腎等重要器官的代謝情況。
　　結(jié)果：我們合成的DIONs流體動力學直徑為165nm，可將氧化鐵納米簇離子包裹起來，形成穩(wěn)

11、定納米結(jié)構(gòu);有很好的水溶性、磁性和穩(wěn)定性，而且本身為深棕色。其合適的大小、穩(wěn)定性及黑褐色使得經(jīng)過胃壁漿膜下注射后淋巴結(jié)特異性好，6小時后區(qū)域淋巴結(jié)開始染色，24小時染色時間最佳，48小時后逐漸褪色但仍可清晰辨認，得到良好的區(qū)域淋巴結(jié)示蹤效果。通過DIONs與人淋巴細胞共培養(yǎng)及CCK-8法檢測，可見其有良好的體外細胞生物安全性。通過長時間（漿膜下注射4天至3個月）對大鼠血液學及組織病理學觀察，DIONs具有良好的生物安全性及相容性。通過D