納米炭在乳腺癌腋窩淋巴結應用的實驗與臨床研究.pdf

1、目的：
　　本研究以納米炭吸附表阿霉素對乳腺癌腋窩淋巴結示蹤及靶向化療進行初步探索研究。首先，進行納米炭與表阿霉素最合適的吸附配比及解吸附實驗，其次，用乳腺癌兩種細胞系MDA-MB-231和MCF-7進行體外培養(yǎng)，研究納米炭-表阿霉素對兩種細胞的體外殺傷或增殖抑制作用，最后，按納入標準收集臨床病例及淋巴結組織標本，初步研究納米炭及納米炭-表阿霉素混懸液對人乳腺癌腋窩淋巴結的示蹤和靶向化療作用，為臨床乳腺癌的治療提供新的思路。

2、>　　方法和結果：
　　1.納米炭對表阿霉素的吸附、解吸附實驗研究
　　方法:利用高效液相色譜質譜(LC-MS/MS)法和透析法測定納米炭對不同濃度表阿霉素的吸附和釋放作用。
　　結果:納米炭對表阿霉素具有良好的吸附性，1ml(50mg)納米炭與2ml濃度為2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml表阿霉素吸附率分別為94.66％、85.96％、80.12％、71.09％、69.03

3、％，隨著藥物濃度的增加，吸附率逐漸降低，達飽和后吸附率穩(wěn)定。1 ml(50mg)納米炭與2 ml濃度為5 mg/ml表阿霉素吸附后可以緩慢釋放表阿霉素，沒有突釋現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，48 h后趨于平衡，累積釋放率可達到65％左右。
　　2.納米炭-表阿霉素對乳腺癌細胞的增殖抑制作用研究
　　方法:采用不同濃度的CNP-EPI處理MDA-MB-231、MCF-7細胞，CCK-8法測定不同濃度、不同時間對MDA-MB-231、MCF-7細胞

4、增殖的抑制作用;根據(jù)測定的IC50選取5μg/ml CNP-EPI，相應濃度25μg/ml CNP及僅加培養(yǎng)基作用24 h后，觀察細胞形態(tài)的變化，流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)測定細胞凋亡率。
　　結果:在1μg/ml～200μg/ml濃度范圍內，CNP-EPI對乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞增殖的抑制作用逐漸增強，48 h后仍有增加的趨勢，但逐漸趨于穩(wěn)定，且各時間段內對細胞的抑制率與藥物濃度呈現(xiàn)劑

5、量依賴關系，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），而相應各濃度CNP對細胞的增殖抑制作用不明顯;5μg/mlCNP-EPI作用細胞24 h后，顯微鏡下可以看到大量的細胞死亡，正常對照組和相應濃度的CNP組細胞生長未見明顯異常;流式細胞儀檢測，CNP-EPI組作用兩種細胞24 h后，MDA-MB-231細胞的凋亡率為(14.37±6.25)％，死亡率可達(80.70±6.20)％;MCF-7細胞晚期凋亡率為(14.57±2.

6、41)％，死亡率可達(78.63±0.55)％，分別與相應濃度CNP組及正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　3.納米炭混懸液在乳腺癌腋窩淋巴結示蹤效果的臨床研究
　　方法:將我科2012年5月至2014年6月收治的60例乳腺癌患者隨機分為A組、B組、C組。A組20例，于術前1天在乳暈周圍分4點皮下注射納米炭混懸液1ml;B組20例，于術前3天在乳暈周圍分4點皮下注射納米炭混懸液1ml;C組20例，于術前7

7、天在乳暈周圍分4點皮下注射納米炭混懸液1ml。手術方式采用開放乳腺癌改良根治術或腔鏡下皮下腺體切除加腋窩淋巴結清掃術或乳腺癌局部擴大切除加腋窩淋巴結清掃術，術后分別記錄淋巴結清掃數(shù)目、淋巴結黑染、轉移情況。
　　結果:A組共清除淋巴結430枚，平均21.5±5.8枚;B組共清除淋巴結384枚，平均19.2±4.9枚;C組共清除淋巴結380枚，平均19.0±5.8枚;A組、B組、C組平均每例患者清除淋巴結數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計學意義(

8、P＞0.05）。A組清除的430枚淋巴結中，黑染337枚，黑染率78.4％;B組清除的384枚淋巴結中，黑染248枚，黑染率64.6％;C組清除的380枚淋巴結中，黑染166枚，黑染率43.7％;三組間淋巴結黑染率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），可以認為三組清除淋巴結總體黑染率之間有差別，A組淋巴結黑染率最高，C組淋巴結黑染率最低。A組共清除轉移淋巴結40枚，其中黑染淋巴結28枚，轉移淋巴結中黑染率70.0％(28/40);B組

9、共清除轉移淋巴結54枚，其中黑染淋巴結33枚，轉移淋巴結中黑染率為61.1％(33/54);C組共清除轉移淋巴結39枚，其中黑染淋巴結22枚，轉移淋巴結中黑染率56.4％(22/39)。三組比較，轉移淋巴結的黑染率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　4.納米炭-表阿霉素在乳腺癌陽性淋巴結靶向化療中作用的研究
　　方法:將我科2014年2月至2014年12月收治的90例乳腺癌患者隨機分為對照組、示蹤組、載藥組。對照組30例

10、，未注射任何示蹤劑。示蹤組30例于術前24 h在乳暈周圍分4點皮下注射納米炭混懸液1 ml。載藥組30例于術前24 h在乳暈周圍分4點皮下注射納米炭-表阿霉素混懸液3 ml。手術方式采用開放乳腺癌改良根治術或腔鏡下皮下腺體切除加腋窩淋巴結清掃術或乳腺癌局部擴大切除加腋窩淋巴結清掃術，每個患者選取淋巴結均不超過2枚。將所取淋巴結平均分成兩份，一份送常規(guī)病理學檢查，另一份再平均分成兩小份，一份福爾馬林固定，石蠟包埋備做細胞凋亡和免疫組化檢查

11、，另一份置于-70℃冰箱冷藏保存，做表阿霉素濃度測定用。剩余淋巴結均送病理科檢查。常規(guī)HE染色篩選出有癌轉移的淋巴結，載藥、示蹤組選取黑染及未黑染的癌轉移淋巴結，對照組選取癌轉移淋巴結連續(xù)切片，做免疫組化Ki-67染色和TUNEL染色。
　　結果:載藥組黑染淋巴結中表阿霉素濃度為(2063.27±1236.39)ng/g，未黑染淋巴結中表阿霉素濃度為(108.77±96.39)ng/g;示蹤組黑染淋巴結中表阿霉素濃度為(143.7

12、2±89.36)ng/g，未黑染淋巴結中表阿霉素濃度為(110.68±56.00)ng/g;對照組淋巴結中表阿霉素濃度為(125.85±72.29)ng/g;載藥組黑染淋巴結中表阿霉素濃度明顯高于示蹤組黑染、未黑染和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);載藥組未黑染淋巴結中表阿霉素濃度同示蹤組黑染、未黑染和對照組比較，無明顯差異(P＞0.05）;示蹤組黑染淋巴結中表阿霉素濃與示蹤組未黑染和對照組之間兩兩比較，無顯著差異(P＞0.05

13、);載藥組黑染淋巴結中表阿霉素濃度明顯高于未黑染淋巴結，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　載藥組黑染癌轉移淋巴結中癌細胞Ki-67增殖指數(shù)為（2.34±0.54）％;示蹤組黑染癌轉移淋巴結中癌細胞Ki-67增殖指數(shù)為（2.49±1.37）％;對照組癌轉移淋巴結中癌細胞Ki-67增殖指數(shù)為（4.81±3.56）％;三組癌轉移淋巴結中癌細胞Ki-67增殖指數(shù)無顯著差異(P＞0.05）
　　載藥組黑染癌轉移淋巴結中癌細胞凋亡

14、指數(shù)為(14.19±6.96)％;示蹤組黑染癌轉移淋巴結中癌細胞凋亡指數(shù)為（7.59±2.84）％;對照組癌轉移淋巴結中癌細胞凋亡指數(shù)為(10.24±3.47)％;三組癌細胞凋亡指數(shù)無顯著差異(P＞0.05)
　　結論：
　　1、納米炭對表阿霉素具有良好的吸附性能和緩釋作用，1ml納米炭與2ml表阿霉素濃度為5mg/ml～10mg/ml混合配比較合適;
　　2、CNP-EPI混懸液對人乳腺癌MDA-MB-231、MCF