不同乳酸菌抗氧化能力比較及其機制的研究.pdf

1、氧化應激是導致機體衰老和與衰老相關疾病的根本原因，不僅如此，它還可能引起多種疾病，例如糖尿病、動脈粥樣硬化、關節(jié)炎、高血脂、心腦血管疾病等。因此，對氧化應激的防治成為近年來的研究熱點。大量研究表明，乳酸菌具有多種益生功能，不僅能夠調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，維持腸道菌群平衡，還具有一定的抗氧化能力，能夠清除腸道內(nèi)的活性氧分子，使機體內(nèi)活性氧分子保持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。
　　本課題選取四株乳酸菌作為研究對象，分別是目前研究最為廣泛的嗜酸乳桿菌

2、（Lactobacillius acidophilus）NCFM，植物乳桿菌植物亞種模式菌株——植物乳桿菌（Lb.plantarum）ATCC14917，具有多種益生功能廣泛應用于多種食品中的鼠李糖乳桿菌（Lb.rhamnosus GG，LGG）和從內(nèi)蒙古通遼地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離而來的、具有多種益生功能的植物乳桿菌（Lb.plantarum）NDC75017。對四株乳酸菌清除自由基的能力進行了比較，然后比較其對受到氧化損傷的Caco

3、-2細胞胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響，最后通過轉(zhuǎn)錄組測序技術深層次探究乳酸菌發(fā)揮抗氧化作用的機制。
　　通過本研究獲得以下結(jié)果:
　　(1)利用自由基清除能力實驗比較了四株乳酸菌的自由基清除能力，分別從羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基方面比較了四株乳酸菌菌體及發(fā)酵液的自由基清除能力。結(jié)果表明:在四株乳酸菌的菌體及發(fā)酵液中，菌體的羥自由基清除率要優(yōu)于發(fā)酵液，而發(fā)酵液的DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除能力要優(yōu)于菌體;鼠李

4、糖乳桿菌LGG的菌體具有最強的羥自由基清除能力;植物乳桿菌NDC75017的發(fā)酵液具有最強的DPPH自由基清除能力，植物乳桿菌ATCC14917發(fā)酵液具有最強的超氧陰離子自由基清除能力。
　　(2)比較了四株乳酸菌緩解Caco-2細胞氧化損傷的能力。將達到極化狀態(tài)的Caco-2細胞暴露于500μM H2O2中30 min，使其受到氧化損傷，然后將四株乳酸菌及其滅活菌體分別與氧化損傷的Caco-2細胞共培養(yǎng)4h后，比較Caco-2細

5、胞胞內(nèi)兩種抗氧化酶——超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的變化情況。結(jié)果表明:與正常細胞相比，受到氧化損傷的Caco-2細胞胞內(nèi)SOD活性顯著降低(P＜0.05)、GSH-Px活性顯著升高(P＜0.05)，四株乳酸菌的活菌均能不同程度緩解胞內(nèi)SOD活性降低和GPx活性升高的情況，尤其是鼠李糖乳桿菌LGG和植物乳桿菌NDC75017表現(xiàn)出了最強的氧化損傷修復能力，但滅活菌體的效果并不明顯。
　　(3)對篩選

6、出的兩株具有較強抗氧化能力的乳酸菌——鼠李糖乳桿菌LGG和植物乳桿菌NDC75017的抗氧化機制進行深入探究，將氧化損傷的Caco-2細胞分別與兩株乳酸菌共培養(yǎng)4h后，提取Caco-2細胞RNA進行表達譜測序，篩選出與氧化應激相關的顯著差異基因，并對其進行GO富集和KEGG富集，研究乳酸菌調(diào)控宿主抗氧化信號通路的機制。結(jié)果顯示:與未處理Caco-2細胞相比，氧化損傷Caco-2細胞8個基因表達量呈現(xiàn)顯著差異，并且都表現(xiàn)為上調(diào)趨勢，它們大

7、都與免疫、發(fā)炎及衰老等信號通路相關;而經(jīng)LGG和NDC75017處理后，這8個顯著差異基因中分別有6個基因和3個基因出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，說明兩株乳酸菌能夠通過下調(diào)與氧化應激相關的基因來發(fā)揮抗氧化作用;同時在GO富集和KEGG富集結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，兩株乳酸菌還能通過激活TNF信號通路中CASP3的表達來促進下游促凋亡蛋白的產(chǎn)生，因此推斷這兩株乳酸菌可能還會促進癌細胞凋亡，也就是具有抗癌作用。
　　(4)利用Real-time PCR方法

8、對DGE測序篩選出的8個基因分別進行了驗證，結(jié)果表明這8個基因Real-time PCR表達量改變倍數(shù)與DGE測序數(shù)據(jù)結(jié)果中差異基因表達倍數(shù)基本保持趨勢一致，這也證明了DGE測序獲得的信息具有比較高的準確性。
　　通過本課題揭示了四株乳酸菌自由基清除能力及緩解Caco-2細胞氧化損傷的能力，篩選出了兩株具有較強抗氧化能力的乳酸菌，并通過DGE測序技術探究了其發(fā)揮抗氧化作用的分子機制，為今后篩選具有抗氧化作用的益生菌提供了理論基礎，