羥基功能化離子液體用于蛋白質(zhì)分離分析方法研究與應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)是生命與各種形式的生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與生物體的新陳代謝、基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)換等生命現(xiàn)象。離子液體作為一種綠色溶劑，具有許多獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，已獲得廣泛關(guān)注。離子液體雙水相萃取技術(shù)是提取和純化生物活性物質(zhì)的一種新型分離方法。功能化離子液體雙水相體系能有效地將離子液體與雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，具有無(wú)毒、安全、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化，分離純化蛋白質(zhì)、核酸和病毒等多個(gè)研究領(lǐng)域。功能化離子液體磁性固相萃取技術(shù)是在磁

2、性固相萃取劑的表面修飾上功能化離子液體，從而形成具有某種特定功能或者應(yīng)用的一種新型固相萃取技術(shù)。
　　近年來(lái)，隨著“綠色化學(xué)”理念的興起，建立一種快速、高效的蛋白質(zhì)分離、提取和檢測(cè)的方法顯得尤為迫切。本研究選用羥基類功能化離子液體作為萃取劑，結(jié)合雙水相萃取技術(shù)和磁性固相萃取技術(shù)，應(yīng)用于蛋白質(zhì)的萃取分離研究。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、羥基功能化離子液體-雙水相體系萃取分離蛋白質(zhì)
　　研究?jī)?yōu)化合成了醇羥基類功能化離子液體

3、并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，以此作為萃取劑，結(jié)合雙水相體系萃取技術(shù)對(duì)牛血清蛋白（BSA）進(jìn)行了萃取分離分析。采用紫外光譜分析法在278nm處對(duì)BSA進(jìn)行定性及定量分析檢測(cè)。研究通過(guò)一系列單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)萃取體系中影響萃取效率的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)確定了萃取工藝參數(shù)的最佳組合為：離子液體加入量為1.6 mg，K2HPO4加入量為2.2 mg，BSA加入量為2 mL（濃度為5 mg/mL），萃取溫度25℃和萃取時(shí)間為25 min，得到萃取率

4、為99.6％。方法學(xué)考察結(jié)果表明：儀器精密度、方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均良好。方法學(xué)考察結(jié)果表明：儀器精密度、方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，其RSD分別為0.27%、0.11%和1.5%。研究通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、動(dòng)態(tài)光散射儀和透射電子顯微鏡對(duì)離子液體—雙水相體系萃取牛血清蛋白的機(jī)理進(jìn)行了探討。并通過(guò)圓二色譜對(duì)蛋白質(zhì)萃取前后結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：萃取后，蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有被破壞。
　　2、羥基功能化離子液體—納米粒子磁固相體

5、系萃取分離蛋白質(zhì)
　　研究選用羥基功能化離子液體，通過(guò)化學(xué)鍵合的方式修飾在表面包覆有二氧化硅的Fe3O4納米顆粒上，以此作為固相萃取劑，通過(guò)磁性固相萃取技術(shù)對(duì)牛血清蛋白(BSA)進(jìn)行了萃取分離分析。通過(guò)紅外光譜、透射電子顯微鏡、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)、X射線衍射及熱重分析儀對(duì)所合成的磁性固相萃取劑進(jìn)行了表征。采用紫外光譜分析法在278 nm處對(duì)BSA進(jìn)行定性及定量分析檢測(cè)。研究通過(guò)一系列單因素實(shí)驗(yàn)確定了最優(yōu)的萃取條件為：羥基功能化的磁性顆

6、粒的加入量60 mg，BSA的加入量為2 mL(濃度為0.5 mg/mL)，溶液的pH值為6，萃取時(shí)間為20 min和萃取溫度為30℃，得到萃取率為86.9%。方法學(xué)考察結(jié)果表明：儀器精密度、方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，其RSD分別為0.55%、1.5%和1.3%。當(dāng)洗脫液NaCl的濃度為1.1 mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)的洗脫率為94.9%。
　　3、雙羥基功能化離子液體—多壁碳納米管磁性固相體系萃取分離蛋白質(zhì)
　　研究合成了雙羥基

7、功能化離子液體，并通過(guò)靜電自組裝的方式修飾在具有磁性的多壁碳納米管上，以此作為固相萃取劑，結(jié)合磁性固相萃取技術(shù)，對(duì)溶菌酶(Lysozyme，Lys)進(jìn)行了萃取分離分析。通過(guò)紅外光譜、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)、透射電子顯微鏡、X射線衍射及熱重分析儀對(duì)所合成的磁性固相萃取劑進(jìn)行了表征。采用紫外光譜分析法在278 nm處對(duì)Lys進(jìn)行定性及定量分析檢測(cè)。經(jīng)過(guò)一系列單因素實(shí)驗(yàn)獲得最優(yōu)萃取條件為：雙羥基功能化的磁性碳納米管的加入量為10 mg，Lys的加入量

8、為1 mL（濃度為1.0 mg/mL），萃取時(shí)間為20 min和萃取溫度為30℃，得到的萃取容量為94.6 mg/g。方法學(xué)考察結(jié)果表明：儀器精密度、方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，其 RSD分別為0.37%、0.47%和0.52%。用0.005 mol/L Na2HPO4和1 mol/L NaCl的混合溶液作為洗脫液時(shí)，溶菌酶的洗脫率為91.6%。實(shí)驗(yàn)還對(duì)比了其它不同類型的磁性固相萃取劑對(duì)溶菌酶的萃取容量和雙羥基功能化離子液體—磁性固相萃取體