NaCS-PDMDAAC生物微膠囊成囊特性及固定化法生產(chǎn)1，3-丙二醇的研究.pdf

1、生物微膠囊作為最常用的固定化活細(xì)胞技術(shù)，受人工器官、基因治療及生物化工等領(lǐng)域發(fā)展的推動(dòng)，引起研究者的廣泛興趣。聚電解質(zhì)成膜反應(yīng)以其溫和快速的特點(diǎn)成為制備生物微膠囊的最重要方法。本文以纖維素硫酸鈉(NaCS)/聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDMDAAC)為聚電解質(zhì)成囊反應(yīng)的代表，提出了改變膠囊大小及膜特性的方法，研究了聚電解質(zhì)成膜反應(yīng)特性與聚電解質(zhì)溶液特性之間的關(guān)系，并應(yīng)用NaCS/PDMDAAC微膠囊固定化Candidakrusei和Kle

2、bsiellapneumoniae，最后通過二過程的串聯(lián)實(shí)現(xiàn)了葡萄糖到1,3-丙二醇的轉(zhuǎn)化。 首先，建立了可控制膠囊大小的氣流微囊發(fā)生器。該裝置通過調(diào)節(jié)氣速來(lái)控制液滴大小，進(jìn)而控制膠囊的大小，可有效調(diào)節(jié)膠囊直徑在1.0mm到2.6mm之間，并建立了氣速大小與膠囊大小之間的關(guān)系式。 其次，在纖維素硫酸鈉(NaCS)—聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDMDAAC)膠囊體系的基礎(chǔ)上，通過引入羧甲基纖維素(CMC)，制備得到一種新型的

3、三組分CMC-NaCS/PDMDAAC膠囊。以開始收縮時(shí)間、直徑、膜厚和機(jī)械強(qiáng)度等宏觀特性為膠囊的考察對(duì)象，研究了不同反應(yīng)物濃度、不同反應(yīng)條件下，制備得到的CMC-NaCS/PDMDAAC膠囊的特性。以強(qiáng)度為衡量標(biāo)準(zhǔn)，CMC-NaCS/PDMDAAC膠囊的較優(yōu)的反應(yīng)條件為：35-40g/LNaCS，6-8g/LCMC，60g/LPDMDAAC在25℃下反應(yīng)30-40分鐘。并詳細(xì)研究了小分子物質(zhì)(葡萄糖、甘油、酪氨酸和維生素B12)透過膠

4、囊的擴(kuò)散特性，初步考察了膠囊穩(wěn)定性及菌的泄漏情況。 第三，在對(duì)CMC-NaCS/PDMDAAC膠囊研究的基礎(chǔ)上，詳細(xì)考察了添加其它類型物質(zhì)(中性小分子、中性聚合物、小分子鹽)對(duì)NaCS/PDMDAAC體系膠囊的影響，并對(duì)影響方式進(jìn)行了定性的分析。通過測(cè)定添加物對(duì)聚電解質(zhì)稀溶液比濃粘度、Zeta電位，以及對(duì)聚電解質(zhì)陰陽(yáng)離子反應(yīng)后懸濁液濁度、Zeta電位的影響，將稀溶液特性與制備膠囊過程關(guān)聯(lián)。提出了改善膠囊特性的二種方式：一是添加物

5、參與聚電解質(zhì)體系的反應(yīng)(如CMC引入NaCS/PDMDAAC體系)，二是添加物對(duì)聚電解質(zhì)在溶液中的伸展特性要有強(qiáng)烈的影響(如PEG6000和NaCl引入NaCS/PDMDAAC體系)。 第四，應(yīng)用NaCS/PDMDAAC微膠囊包埋產(chǎn)甘油耐高滲酵母Candidakrusei。通過研究滲透壓添加劑(NaCl、PEG4000、甘油)對(duì)酵母生長(zhǎng)和產(chǎn)甘油特性的影響，發(fā)現(xiàn)胞外高滲環(huán)境會(huì)不同程度抑制酵母的生長(zhǎng)，但是確實(shí)有利于甘油的生成。甘油作

6、為滲透壓調(diào)節(jié)劑效果最好，在初始甘油濃度為80g/L時(shí)，獲得的最高凈甘油濃度為99g/L(除去初始甘油濃度80g/L)，此時(shí)的甘油/葡萄糖轉(zhuǎn)化率為最大，達(dá)到55％，產(chǎn)率約為22gL-1Day-1。研究了NaCS/PDMDAAC生物微膠囊包埋Candidakrusei的培養(yǎng)過程中囊內(nèi)細(xì)胞濃度、囊內(nèi)外葡萄糖和甘油濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況，發(fā)現(xiàn)由于傳遞問題使囊內(nèi)底物濃度偏低不能為細(xì)胞提供產(chǎn)甘油所需的高滲環(huán)境，結(jié)果導(dǎo)致普通包埋時(shí)細(xì)胞因周圍環(huán)境變化

7、而產(chǎn)生代謝遷移，出現(xiàn)二次生長(zhǎng)的現(xiàn)象。提出了將高于細(xì)胞截留分子量的PEG4000包埋于NaCS/PDMDAAC膠囊中，為囊內(nèi)酵母C.krusei提供一個(gè)持續(xù)的局部高滲微環(huán)境的方法，與普通包埋相比不僅能夠大大縮短發(fā)酵的周期，而且最終甘油濃度亦提高25％左右，但是會(huì)有較高的殘?zhí)菨舛?。并且在氣升反?yīng)器中進(jìn)行了五批次的實(shí)驗(yàn)，獲得較穩(wěn)定的結(jié)果，甘油濃度為65g/L左右，甘油葡萄糖轉(zhuǎn)化率為0.35g/g左右，產(chǎn)率為21gL-1Day-1。 第

8、五，應(yīng)用NaCS/PDMDAAC微膠囊包埋兼性厭氧的產(chǎn)1,3-丙二醇克雷伯肺炎桿菌Klebsiellapneumoniae。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)12h發(fā)酵囊內(nèi)菌濃可達(dá)6g/L，而游離培養(yǎng)經(jīng)27h只有2.66g/L，表明微囊化細(xì)胞可獲得高密度細(xì)胞培養(yǎng)；并得到0.62mol/mol的1,3-丙二醇/甘油轉(zhuǎn)化率，高于游離培養(yǎng)的0.55mol/mol。由于膠囊膜對(duì)傳質(zhì)的影響，使得囊內(nèi)甘油濃度在發(fā)酵過程中始終處于較低范圍內(nèi)，因此微膠囊固定化方法可以

9、有效避免Klebsiellapneumoniae發(fā)酵過程中的底物抑制問題。通過對(duì)不同初始甘油濃度(40g/L、60g/L、80g/L、120g/L)發(fā)酵結(jié)果的比較，固定床反應(yīng)器批式發(fā)酵結(jié)果證實(shí)，K.pneumoniae經(jīng)包埋后囊外較高的初始底物濃度不會(huì)抑制囊內(nèi)菌的生長(zhǎng)和1,3-丙二醇的生成，并能得到較高的1,3-丙二醇/甘油轉(zhuǎn)化率。在初始甘油濃度為120g/L時(shí)，最終1,3-丙二醇的濃度為63.1g/L，1,3-丙二醇/甘油轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率

10、分別高達(dá)0.65mol/mol、5.74gL-1h-1。在多批次補(bǔ)料研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中不能及時(shí)排除的副產(chǎn)物乙醇的累積會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵停止，更換新鮮培養(yǎng)基后發(fā)酵可繼續(xù)進(jìn)行。在固定床反應(yīng)器連續(xù)操作中，較低的稀釋率下1,3-丙二醇濃度和轉(zhuǎn)化率較高，但產(chǎn)率較低，而較高稀釋率下情況與之相反。 第六，通過串聯(lián)分別用微膠囊包埋的產(chǎn)甘油耐高滲酵母Candidakrusei和產(chǎn)1,3-丙二醇克雷伯肺炎桿菌Klebsiellapneumoniae，實(shí)