嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株第2套Ⅱ型分泌系統(tǒng)全基因簇序列測定分析及其E基因部分敲除.pdf

1、目的本實(shí)驗(yàn)室自2003年從沙蠶消化道分離出一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株，研究發(fā)現(xiàn)該菌可胞外大量分泌有堿性磷酸酶活性的D2蛋白。根據(jù)已測定出的部分基因組序列，發(fā)現(xiàn)編碼D2蛋白的基因與Ⅱ型蛋白分泌系統(tǒng)基因成簇排列，故推測嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株的D2蛋白可能與Ⅱ型蛋白分泌系統(tǒng)有關(guān)。測定嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株第二套Ⅱ型分泌系統(tǒng)(T2SS2)全基因簇(Gsp)的基因序列，并對所測定的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，再此基礎(chǔ)上構(gòu)建嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株的T2

2、SS2的⊿Gsp2E基因缺失株，分析T2SS2的Gsp2E對嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株分泌D2蛋白的影響。
　　方法1.根據(jù)Genbank基因組計(jì)劃中公布的4株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌K279a、JV3、D457、R551-a(Genbank登陸號依次為:NC_01094、NC_015947、NC_017671、NC_011071)的Ⅱ型分泌系統(tǒng)基因簇序列，以及D2株的部分測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，采用基因移步法逐一PCR擴(kuò)增第2套Ⅱ型分泌系統(tǒng)基因序

3、列，PCR產(chǎn)物連接至pGEM-18T載體，藍(lán)白斑選擇后經(jīng)酶切鑒定送往測序公司測序，序列結(jié)果拼接后尋找各個基因簇的開放多碼框架(ORF)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。2.通過PCR來擴(kuò)增氯霉素基因和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株Gsp2E基因的上下游片段，分別作為上游和下游的同源臂，采用搭橋PCR方法將上游同源臂、氯霉素基因及下游同源臂連接。對搭橋PCR片段和自殺質(zhì)粒pGEX-18TC分別進(jìn)行雙酶切之后用連接酶連接，獲得重組自殺質(zhì)粒⊿2E-pEX-18

4、TC，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SM10λpir株中。通過第一次同源重組，將自殺質(zhì)粒⊿E-pEX-18TC轉(zhuǎn)入嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株中，利用氯霉素和鏈霉素雙抗平板篩選出結(jié)合子。通過第二次同源重組篩選出⊿2E缺失株，并進(jìn)行PCR鑒定。
　　結(jié)果1.共獲得嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株第二套Ⅱ型分泌系統(tǒng)基因簇共11個片段，依次為Gsp2E、Gsp2F、Gsp2G、Gsp2H、Gsp2I、Gsp2J、Gsp2K、Gsp2L、Gsp2M、Gsp2N、

5、Gsp2D。對應(yīng)的GenBank收錄號依次為KF234409、KF234410、KF234411、KF234412、KF2344113、KF234414、KF234415、KF234416、KF234417、KF234418、KF234419。對上述11個ORF比對分析后發(fā)現(xiàn)T2SS2的基因簇與同種屬細(xì)菌K279a，R551-a對應(yīng)蛋白基因同源性均在85％以上，相應(yīng)氨基酸序列同源性均能達(dá)到70％以上，與T2SS1相比，兩套Ⅱ型分泌系統(tǒng)之

6、間有一定的同源性，其中以E基因片段為代表，基因同源性最高為68％，相應(yīng)蛋白同源性為61％，其余基因簇片段基因及蛋白同源性均不及E基因高，大多位于30％左右。此外對以上11個ORF和來源明確的其他細(xì)菌相應(yīng)蛋白做系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)第二套Ⅱ型分泌系統(tǒng)基因簇有種屬特異性。2.通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對⊿Gsp2E嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株的D2蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)⊿Gsp2E嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株與野生株在D2蛋白量上無明顯差別，藥敏實(shí)驗(yàn)顯示:與