銅離子對小鼠原代肝細(xì)胞及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的毒性效應(yīng)的研究.pdf

1、銅是生物體必需的微量元素之一，對生命活動具有舉足輕重的作用。然而，銅作為一種重金屬，在能源、電鍍、建筑、交通運(yùn)輸、軍事武器等行業(yè)的應(yīng)用十分廣泛，銅對環(huán)境造成的污染問題也越來越嚴(yán)重，其對健康的危害也越來越突出。重金屬銅可通過消化道、呼吸道和皮膚等吸收進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)血液循環(huán)輸送到各個器官，并在肝臟、腎臟、大腦等器官處積累，造成細(xì)胞、器官以及機(jī)體的氧化損傷。
　　眾多疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激效應(yīng)密切相關(guān)。研究表明，銅類污染物可誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激

2、，使機(jī)體產(chǎn)生過量的活性氧，打破機(jī)體正常的氧化還原平衡，造成生物大分子、脂類物質(zhì)、DNA的氧化損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞氧化損傷或功能紊亂，誘發(fā)疾病等。重金屬類污染物的毒性效應(yīng)往往體現(xiàn)在分子、細(xì)胞和動物三個層面上，單一層面的評價不足以全面闡明銅的毒性效應(yīng)。因此，有必要從多個層次探究銅離子暴露誘發(fā)的氧化損傷毒性機(jī)理和揭示銅暴露健康損害的微觀機(jī)制。
　　本文從銅毒性作用與氧化應(yīng)激效應(yīng)的相關(guān)性入手，以細(xì)胞毒理學(xué)和分子毒理學(xué)為依托，從細(xì)胞和分子水平

3、上評價銅暴露誘發(fā)細(xì)胞氧化損傷的毒性效應(yīng)、機(jī)理以及銅與蛋白質(zhì)作用機(jī)理。本文包括以下五個部分:
　　第一部分:介紹了銅污染誘發(fā)的毒性作用、氧化應(yīng)激效應(yīng)以及銅誘發(fā)的毒性效應(yīng)與氧化應(yīng)激的關(guān)系。介紹了本研究領(lǐng)域的進(jìn)展、存在的問題，論文涉及的主要技術(shù)方法、論文的研究內(nèi)容與意義等。
　　第二部分:選取小鼠原代正常肝細(xì)胞為研究對象，從群體細(xì)胞和單細(xì)胞水平評估短期銅暴露誘發(fā)的氧化損傷效應(yīng)。銅暴露后細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的突出表現(xiàn)就是細(xì)胞內(nèi)ROS水平升

4、高，MDA含量升高、GSH含量下降、氧化應(yīng)激酶SOD活性的升高。同時，由于ROS含量水平的升高和氧化防御機(jī)制的改變，銅暴露誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷。此外，群體細(xì)胞平均分析水平上ROS的產(chǎn)生、GSH的消耗以及DNA的損傷程度在較低濃度(10或50μM)變化并不顯著，但是通過單細(xì)胞水平分析發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞內(nèi)的上述指標(biāo)已經(jīng)發(fā)生變化，高ROS水平、低GSH含量以及具有明顯DNA損傷特征的細(xì)胞在低濃度銅染毒組中開始出現(xiàn)，說明單細(xì)胞水平上能更靈敏地評價

5、污染物早期的毒性效應(yīng)，有利于早期診斷、預(yù)警技術(shù)的建立。
　　第三部分:以氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶過氧化氫酶(CAT)為研究對象，從細(xì)胞和分子兩個層面上研究了Cu2+對CAT的結(jié)構(gòu)和功能的影響。研究表明，銅暴露誘發(fā)的氧化應(yīng)激效應(yīng)導(dǎo)致了小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)CAT酶活性的下降;同樣，Cu2+可通過與CAT的結(jié)合作用抑制了離體的CAT酶的活性。分子水平上的研究結(jié)果表明Cu2+可引起CAT熒光猝滅，導(dǎo)致其骨架結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的改變。兩者可能的結(jié)合位置位于活

6、性中心的β-折疊附近，Cu2+與His74（組氨酸）和Ser113（絲氨酸）發(fā)生相互作用。過氧化氫酶二級結(jié)構(gòu)的改變和銅離子與His74氨基酸的結(jié)合是酶活性發(fā)生顯著下降的主要原因。
　　第四部分:以氧化應(yīng)激相關(guān)酶溶菌酶（Lysozyme）為研究對象，利用多種光譜學(xué)手段、等溫滴定量熱技術(shù)ITC及分子模擬、酶活性測試等方法研究了Cu2+與溶菌酶的相互作用機(jī)理。研究表明，Cu2+與溶菌酶結(jié)合反應(yīng)是一個自發(fā)地過程，其主要作用力是疏水作用力，

7、298 K時大約有3個結(jié)合位點(diǎn)。一定濃度的銅離子會致使溶菌酶發(fā)生熒光靜態(tài)猝滅，改變了色氨酸殘基的微環(huán)境，使得溶菌酶蛋白質(zhì)骨架變得疏松、二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。而且基于活性殘基谷氨酸(Glu35)和（天冬氨酸）Asp52位于銅與溶菌酶的結(jié)合部位，銅暴露影響了溶菌酶活性的表達(dá)。
　　第五部分:以生物大分子人血清白蛋白(HSA)為研究對象，分子水平上研究了銅離子對HSA結(jié)構(gòu)和功能的影響以及兩者相互作用的機(jī)理。研究表明，銅離子主要以動態(tài)猝滅形式