平胸龜三個(gè)亞種的有效性及線粒體雙控制區(qū)進(jìn)化模式的研究.pdf

1、平胸龜(Platysternon megacephalum)是平胸龜科現(xiàn)存唯一的代表種?；跀?shù)量性狀的測(cè)量、形態(tài)學(xué)的分析以及地理分布情況,目前認(rèn)為其包含3個(gè)亞種:中國(guó)亞種(P.m.megacephalum)、越南亞種(P.m.shiui)和緬甸亞種(P.m.peguens)。但是,形態(tài)學(xué)特征是隨個(gè)體發(fā)育而不斷變化的,存在一定的局限性,尤其是對(duì)于在分布區(qū)上有重疊的物種,因?yàn)闈撛诘奈锓N間雜交可能導(dǎo)致難以有效區(qū)分的形態(tài)學(xué)特征。因此,有必要在分

2、子水平上探究平胸龜三個(gè)亞種的有效性。
　　本研究采用特異 PCR技術(shù),測(cè)序了平胸龜10只標(biāo)本的線粒體控制區(qū)及其側(cè)翼序列和14個(gè)核基因的DNA序列,探討了平胸龜現(xiàn)存亞種的有效性。mt DNA控制區(qū)的比較結(jié)果顯示,在緬甸亞種的TAS區(qū)5’端存在一個(gè)長(zhǎng)130 bp的串聯(lián)重復(fù)序列和一個(gè) poly-C結(jié)構(gòu),在其他兩個(gè)亞種中沒有發(fā)現(xiàn)這2個(gè)特征;緬甸平胸龜 VNTRs區(qū)重復(fù)基序?yàn)?TATTA,而中國(guó)和越南亞種重復(fù)基序比較復(fù)雜,包括 TGTTA和

3、 GTTGTTATATAATATAT。顯示緬甸亞種與中國(guó)亞種、越南亞種間存在較大的差異。在此基礎(chǔ)上,我們分別計(jì)算了三個(gè)亞種間 mt DNA控制區(qū)和14個(gè)核基因序列的平均遺傳距離,并采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯方法(Bayesian Inference, BI)構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果顯示,緬甸亞種與(中國(guó)亞種+越南亞種)分歧顯著,形成獨(dú)立的一支且具有很高的支持率,平均遺傳距離為0.093(mt D

4、NA)和0.009(nu DNA),已達(dá)到種的分化水平?；谝陨蠑?shù)據(jù),我們建議將緬甸亞種提升為獨(dú)立的種,命名為Platysternon peguense.
　　控制區(qū)(control region)是線粒體(mitochondrion, mt)DNA中最長(zhǎng)的非編碼區(qū),包含參與 mt DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件。大多數(shù)后生動(dòng)物的線粒體基因組中只含有一個(gè)控制區(qū),但是越來越的研究顯示在不同分類群的動(dòng)物中,mt DNA中存在多個(gè)控制區(qū)(C

5、Rs)現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究顯示,平胸龜 mt DNA結(jié)構(gòu)特殊,與典型的脊椎動(dòng)物的mt DNA相比,包含了6個(gè)基因(tRNAHis/tRNASer/tRNALeu/nad5和 tRNAThr/tRNAPro)的重新排列,以及2個(gè) CRs。這2個(gè) CRs的序列有很高的相似度。前人對(duì)雙控制區(qū)進(jìn)化的研究表明,多數(shù)物種的雙控制區(qū)是協(xié)同進(jìn)化的(concerted evolution),但也有部分研究顯示雙控制區(qū)有多種進(jìn)化模式。平胸龜?shù)腃Rs是如

6、何進(jìn)化的迄今尚無研究報(bào)道。
　　我們從平胸龜分布地采集了22只樣本,采用 Long-PCR和巢式 PCR(nestPCR)方法擴(kuò)增了平胸龜 mt DNA雙控制區(qū)序列,結(jié)合系統(tǒng)發(fā)生分析和重組檢測(cè)分析,從微進(jìn)化的水平上探討了平胸龜 mt DNA雙控制區(qū)的進(jìn)化模式。采用臨接法(Neighbor-Joining)、最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯方法(Bayesian Inference, BI)構(gòu)建雙控

7、制區(qū)(除 VNTRs)間的系統(tǒng)發(fā)生樹,結(jié)果顯示,在所有的聚類支中,來自不同個(gè)體的直系同源拷貝聚在一起,而來自同一個(gè)體的并系同源拷貝(CRⅠ和 CRⅡ)卻沒有聚在一起。這些結(jié)果表明,平胸龜雙控制區(qū)可能是獨(dú)立進(jìn)化,而不是協(xié)同進(jìn)化的。
　　此外,我們還發(fā)現(xiàn)在所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹中,T2的CRⅠ與 B支聚類,而 CRⅡ則與 C支發(fā)生聚類。結(jié)合核基因數(shù)據(jù),我們證明了T2個(gè)體是緬甸亞種與越南亞種的雜交后代?；诖?我們推測(cè)平胸龜 mt DNA雙

8、控制區(qū)可能起源于異源重組。
　　利用 RDP軟件,我們對(duì)獲得的22只個(gè)體的雙控制區(qū)序列進(jìn)行了重組測(cè)試分析,結(jié)果顯示,重組發(fā)生的位置位于420 bp和1080 bp處。在菲律賓犀鳥(Aceros waldeni)的mt DNA的TAS區(qū)存在一個(gè)復(fù)制叉屏障。經(jīng)過序列比對(duì)分析,我們發(fā)現(xiàn)位于420 bp處的斷裂點(diǎn)附近存在這個(gè) RFB(replication forks barrier, RFB)的同源序列,可能與重組有關(guān)。此外,我們?cè)?C

9、RⅠ的第二斷裂點(diǎn)(1080 bp)發(fā)現(xiàn)數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTRs),該序列存在亞種特異的長(zhǎng)度和基序異質(zhì)性,可能為重組的發(fā)生提供了序列基礎(chǔ)。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn) CRⅡ的第二斷裂點(diǎn)(1080 bp)下游的序列與珊瑚綱 mt Muts基因存在同源性,推測(cè)這段序列參與 CRⅡ及其側(cè)翼 tRNA的修復(fù)。正是因?yàn)樯鲜鲋亟M元件的存在,才保證平胸龜 CRs在獨(dú)立進(jìn)化過程中,序列保持高度相似,維持功能的穩(wěn)定。
　　本研究首次利用分子生物學(xué)方法